TGF-β ابتدا توسط ماکروفاژها، نوتروفیل ها، لنفوسیت ها و پلاکت ها آزاد می شود. TGF-β به عنوان یک کمپلکس غیرفعال با پروتئین های وابسته و پروتئین های متصل به TGF-β که جزئی از ماتریکس خارج سلولی هستند تولید می شود این پروتئین ها این پتانسیل را دارند که ذخیره شوند و از TGF-β آزاد شوند. پنج ایزوفرم TGF-β تا کنون شناسایی شده اند که در پستانداران تنها TGF-β1-3 وجود دارد]13[.
درون کلیهها فاکتورهای بیشماری بیان TGF-β را افزایش می دهند شامل آنژیوتنسین2، آندوتلین1، اینترلوکین1β، فاکتور فعال گر پلاکت( paf) ، ترومبوکسان، ترومبوسپوندین، گلوکز، انسولین، پروتئین های اسیدی ترشحی غنی از سیستئین می شود TGF-β همچنین در کلیه ها توسط TNF-α و فاکتور رشد اتصالی بافت افزایش بیان پیدا می کند]6[. TGF-β1 یکی از اعضای این خانواده است که از کاندیدهای بالقوه فاکتورهای پروگنوز برای پیشبرد آسیب های کلیوی و بیماری های حاد کلیوی می باشد.
TGF-β1 یک سایتوکاین چند عملکردی است که رشد سلولی، تمایز و تولید ماتریکس خارج سلولی و پاسخ ایمنی را تنظیم می کند که توسط چندین نوع سلول ترشح می شود و فیبروزیس را در یک سری از بافت ها مثل کلیه، قلب و رگهای خونی القا میکند نقش ضروری که این سایتوکاین در تکامل و پیشرفت کلیوی بازی میکند مستند شده است. چندین مطالعه پیشنهاد میکنند کهTGF-β1 در پاتوژنز ناهنجاریهای مادرزادی یوروپاتیها، پیلونفریت حساس و اسکار کلیوی متعاقب دخیل است]15[. ژن کد کننده TGF-β1 انسانی بر روی کروموزوم 19q13.1-13.3 قرار دارد و شامل هفت اگزون است چندین پلی مورفیسم این ژن تا کنون شناسایی شده اند که سه پلی مورفیسم در بخش پروموتور در نواحی 988-، 800- و 509- قرار دارند شکل 1-6 بعضی از پلی مورفیسم های TGF-β1 را نشان می دهد]13[ .
برخی از مطالعات نقش ژن TGF-β1 در عفونت دستگاه ادراریUTI، ریفلاکس نفروپاتی و عفونت پس از اسکار کلیوی را مشخص کردند این مطالعات نشان دادند که استرس های مکانیکی و هیدرودینامیکی ایجاد شده با VUR می تواند ترشح TGF-β1 از سلول های جوانه حالب را القا کند]14[.
همچنین، اطلاعاتی وجود دارد که پیشنهاد میکند TGF-β1 و آنژیوتنسین∏ بیان یکدیگر را تنظیم میکنند بنابراین TGF-β1 می تواند یک فاکتور مهم در پاتوژنز VUR، UTI و اسکار کلیوی باشد]29[. TGF-β1 برای فعال کردن تغییرات فنوتیپیکی سلولی دخیل درالتیام زخم ها/اسکار و انکوژنز نقش دارد]8[. TGF-β1 رشد و شاخه دار شدن جوانه حالب را تنظیم می کند به طوری که به شکل یک سیستم جمع آوری حالب ها درآید. ژن کد کننده TGF-β1 پلی مورفیک است، پلی مورفیسم های TGF-β1 با استعداد ابتلا به UTI و VUR و اسکار کلیوی مرتبط هستند و می توانند به عنوان یک فاکتور خطر برای VUR وعفونت ابتدایی مهم باشند. همانطور که گفته شد تا کنون چندین پلی مورفیسم در ژن TGF-β1 مثل509 – و800- و869+ شناسایی شده است، مدارکی وجود دارد که نشان دهنده توانایی یک فرد برای تولید سطوح بالا و پایین TGF-β1 می باشند که میتواند به صورت ژنتیکی تعیین شود. پلی مورفیسم های 509- و 869+ می توانند با سنتز بالاتر وپایین تر TGF-β1 در In vitro ارتباط داشته باشند]15[ و گزارش هایی مبنی بر ارتباط پلی مورفیسم های ژن TGF-β1 و اسکار کلیوی وجود دارد. ناهنجاری های بیان TGF-β1 در حین تکامل کلیه می تواند موجب افزایش احتمال پیشرفت VURو یا دیسپلازی شود]14[. در یک مطالعه دو پلی مورفیسم C869T+ و T509C- ژن TGF-β1 بررسی شدند که با فعالیت رونویسی ژن و یا سطح سرم تولیدی ژن ارتباط داشتند. نتایج نشان داد که T509C- با VUR فامیلی در ارتباط است همینطور افرادی با پلیمورفیسم 509CC- و 869TT+ میتوانند در بالاترین ریسک برای VUR باشند]8و15[ تا به امروز مارکر ژنتیکی قابل اعتمادی برای VUR شناسایی نشده است، اگر چه تا کنون جوانه زدن نابجای رویانی حالب به عنوان یک مکانیسم برای پیشرفت VUR پیشنهاد می شود و ژن های دخیل در این فرایند به عنوان ژنهای کاندید بالقوه برای استعداد VUR مورد توجه قرار می گیرند]18[. وابستگی نامتعادل اغلب میان پلی مورفیسم های A800G- و T509 C-ویا T509C- و C869T+ مشاهده می شود به نظر میرسد پلی مورفیسم های C869T+ و A800G- و T509C- ژن TGF-β1 میتوانند کاندیدهایی برای مارکر ژنتیکی تکامل و پیشرفت UTI وVUR باشند]29[. مدارکی برای تاثیر مستقیم پلی مورفیسم T509C- بر افزایش بیان ژن TGF-β1 وجود دارد. آلل T در 509- با میزان بالاتر غلظت های TGF-β1مرتبط است و افراد هموزیگوس برای آلل T سطوح بالاتری از TGF-β1 را نسبت به افراد هتروزیگوس دارند]14و17[. آلل T509 -بیشتری در کروموزوم های VUR در مقایسه با کروموزوم های گروه کنترل وجود دارد. در بیماری VUR آللT به طور مکرر یافت میشود به طوریکه ژنوتیپ TT از TGF-β1 بیش بیانی قابل توجهی در بیماران VUR اولیه با نقص کلیوی مزمن نشان می دهد ]15[. با توجه به اهمیت پلی مورفیسمC509T ) (rs1800469 ژن TGF-β1 و ارتباط ان با بیماری ریفلاکس وزیکویورترال اولیه و با توجه به اینکه تا کنون چنین مطالعه ای برای بررسی این پلی مورفیسم در جمعیت ایران صورت نگرفته است این مطالعه درصدد است به بررسی این موضوع بپردازد.
شکل 6-1 نقشه ژن TGF-beta1 انسانی]13[
جدول1-1 ژنها و مکان های ژنی بالقوه دخیل در تکامل کلیه و یا مثانه مسبب بیماری های کلیوی و مثانه ای]8[
1-12 اصول کلی واکنش زنجیره ای پلیمراز
واکنش زنجیره‌ای پلیمراز یا PCR روش ساده و در عین حال حساس برای تکثیر قطعه خاصی از DNA به صورت In vitro است. تکنیک PCR شامل چرخه‌های تکرار شونده‌ای است که در آن به کمک یک سری از پرایمرهای اختصاصی و آنزیم از روی یک رشته DNA توسط حرارت واسرشت می‌شوند. با کاهش در مرحله بعد به توالی‌های مکمل خود متصل می‌شوند. برای شکستن هر باند A=T 2 درجه سانتی‌گراد و برای شکستن هر باند C=G ، 4 درجه سانتی‌گراد دما لازم است که به آن اصطلاحا دمای ذوب TM گفته می‌شود. روند PCR توسط تغییرات دمایی تنظیم می‌شود. دو رشته DNA به وسیله گرما از هم باز می‌شوند و چون غلظت پرایمر زیاد است لذا اتصال پرایمرها به توالی مکمل شان نیازی به مصرف انرژی ندارد.
1-12-1 مواد مورد نیاز برای واکنش PCR
DNA الگو
پرایمرهای اختصاصی جهت تکثیر قطعات مورد نظر
چهار نوکلئوتید DNA (dNTPs) شامل : dATP, dTTP, dCTP, dGTP
آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت مانند Taq-DNA Polymerase
شرایط بافری مناسب و Mg2+
به طور کلی هر چرخه از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز شامل سه مرحله است:
الف- واسرشته شدن
ب- اتصال پرایمرها به قطعات مورد نظر
ج- ساخت رشته مکمل هدف
در این سیستم ساده بافری، آنزیم DNA پلیمراز سبب اتصال مولکول‌های داکسی نوکلئوتید به پرایمرهای شده و قطعه مورد نظر از DNA تکثیر می‌گردد. در مرحله اول در دمای بالا (92 تا 95درجه) باندهای هیدروژنی بین جفت بازهای زنجیره DNA شکسته می‌شود. در مرحله دوم با کاهش دما اجازه داده می‌شود تا پرایمرها ترادف مکمل خود را در زنجیره الگو یافته و به آن متصل شوند که این دما بسته به نوع پرایمرها متفاوت است. جهت تکثیر DNA این چرخه حرارتی سه مرحله‌ای به دفعات تکرار می‌شود. سه مرحله فوق به‌طور خودکار در دستگاهی به نام ترموسایکلر با قابلیت برنامه ریزی صورت می‌گیرد شکل 7-1 مراحل انجام PCR را نشان می دهد.
شکل 7-1 تصویر شماتیک نحوه انجام PCR
1-13 آنالیز PCR-RFLP
با کامل شدن پروژه ژنوم انسان در حدود 3/5 میلیون چند شکلی تک نوکلئوتیدی(SNP) در ژنوم انسان یافت شد که این بدان معنی است که درهر 600 جفت باز یک SNP وجود دارد. از این رو با مطالعه اطلاعات SNP محققین می توانند بیماری های وابسته به ژن را بررسی کنند و ساختار ژنتیکی یک جمعیت را آنالیز نمایند در مقایسه با سایر روش های دیگر مثل Taqman assay، واکنش تشخیصی لیگاز و D-HPLC که در این سالها رشد داشته اند روش PCR-RFLP نسبتا ساده تر و مقرون به صرفه تر است ]28[.