مقدار 10 میلی‌گرم از اتیدیوم‌برماید را وزن نموده و در 20 میلی‌لیتر آب مقطر حل شود. به هنگام استفاده 5 میکرولیتر از محلول فوق را در ژل با حجم 50 میلی‌لیتر بکار برده، بنابراین غلظت اتیدیوم‌برماید در ژل با حجم 50 میلی‌لیتر، معادلg/ml µ 5/0 است.
در هنگام کار با ماده اتیدیوم‌برماید باید توجه داشت که این ماده سمّی بوده و به شدت سرطان‌زاست. بنابراین باید احتیاط‌های لازم جهت استفاده از ماسک و دستکش به عمل آید.
3-11 هضم آنزیمی
نمونههایی که در مرحله الکتروفورز بهترین باندها را داشتند انتخاب کرده و بر روی آنها هضم آنزیمی انجام داده شد. برای هضم آنزیمی از آنزیم برشی Bsu36I استفاده شد.
این آنزیم در ژن TGF-B1 با هضم قطعه 808 جفت بازی از این ژن دو قطعه با اندازههای 617 و 191 جفت بازی تولید میکند (آلل C). درصورت مشاهده باند 808 جفت بازی آلل T بدست خواهد آمد. مواد لازم برای واکنش هضم توسط آنزیم برشی Bsu36I در جدول 3-3 شرح داده شده است. به ازای هر نمونه از 2/0 میکرولیتر آنزیم برشی استفاده میشود. پس از اضافه کردن آنزیم به نمونههای مورد نظر که از واکنش PCR مرحله قبل انتخاب شده بودند، به مدت 4 ساعت و دمای 37 درجه سانتیگراد در دستگاه ترموسایکلرقرار داده شدند. پس از اتمام 4 ساعت نمونهها را بر روی ژل آگارز 2درصد طبق مرحله قبل بارگذاری کرده و جمعیتهای مورد نظر از نظر وجود یا عدم وجود ژن غربال شدند.
جدول 3-3 مواد و مقادیر لازم برای واکنش هضم آنزیمی یک نمونه
نام ماده
مقدار
PCR reaction mixture
10 میکرولیتر
Bsu36I
1-2 میکرولیتر
Nucleas free water
18 میکرولیتر
3-12 روش تجزیه و تحلیل داده ها :
ژنوتیپ های حاصل از نمونه ها و کنترل ها را در یک جدول احتمال 2×3 شمارش ژنوتیپ برای هر گروه به طور مجزا مرتب نموده. برای یک snp با الل های C و T نمونه ها و کنترل ها را با ژنوتیپ CC وCT و TT جدول بندی کرده، چندین روش آنالیز آماری مختلف برای این جدول میتواند به کار رود که در اینجا تمرکز بیشتر بر میزان تطابق است تا روش های رگرسیون. آزمون کای اسکوئر پیرسون برای دستیابی به انحراف از فرضیه صفر بکار میرود که نمونهها و شاهدها توزیع مشابهی از تعداد ژنوتیپ دارند. این آزمون آماری یک توزیع آماری کای اسکوئر با درجه آزادی 2 برای این جدول است.
این روش یک آنالیز آماری معتبر را برای اطلاعات موجود محیا می کند اما از اطلاعات ژنتیکی استفاده نمی کند. اطلاعات را در جدولی با ژنوتیپ های CC، CT، TT نشان داده اگر چه ترتیب ستون در این آزمون آماری مهم نیست و اگر جدول را به گونهای دیگر نیز بچینیم مقادیر مشابهی از آزمون آماری و ارزش p بدست خواهیم آورد.
جدول می تواند با شمارش تعداد آلل های C و تعداد آلل های T که توسط نمونه ها و شاهد ها حمل می شوند از ژنوتیپ به آلل تجزیه شود ( شکل 8-1 روش های آنالیز برای مطالعات وابستگی (SNP این آزمون تحت فرضیه صفر معتبر است..]18[.
3-13بررسی تعادل هاردی-واینبرگ
تحت تعادل هاردی واینبرگ آلل ها به طور تصادفی در جمعیت تفکیک می شوند. مقایسه فراوانی ژنوتیپ های مشاهده شده و مورد انتظار سنجش تعادل هاردی واینبرگ را میسر می سازد( به عنوان مثال بکار بردن آزمون کای اسکوئر). برای آلل های CوT ،فراوانی آلل C برابر P است وفراوانی آلل T برابر q=1-p است. فراوانی های مورد انتظار از ژنوتیپ های CC،CT،TT برابر p2، 2pq و q2 می باشد. فراوانی آلل های p،q معمولا از ژنوتیپ نمونه های مورد آزمایش تخمین زده میشوند تا از اطلاعات ژنوتیپی ظاهری. انحراف از تعادل هاردی واینبرگ عموما با بکار گیری آزمون کای اسکوئر برای دستیابی به میزان انطباق صورت می گیرد]3[. جدول 4-3 محاسبه مرحله به مرحله ژنوتیپ های مورد انتظار را نشان می دهد]18[.
جدول 4-3 محاسبه مرحله به مرحله ژنوتیپ های مورد انتظار
3-14 آزمون کای دو )رابطه بین دو متغیر کیفی)
در نرم افزار spss و روند crosstab تعداد زیادی از آزمون های همبستگی قابل دسترسی است که با آنها مشخص می شود آیا رابطه بین متغیر ها معنی دار است؟ در این روند می توانید همبستگی بین انواع متغیر ها را آزمون کرد یکی از آزمون های عمومی آن، آزمون مربع کای است که برای تعیین رابطه بین متغیر های کیفی مناسب است. هدف این آزمون بررسی استقلال بین دو متغیر غیرعددی است. در آزمون استقلال کای دو حداقل یکی از دو متغیر کیفی و متغیر دیگری می تواند کمی طبقه بندی شده یا ترتیبی باشد.