نگاره شمارۀ 3-12- طول گل آذین و برگ رقم آل مِهتری

نگاره شمارۀ 3-13- طول گل آذین و برگ رقم گُل

نگاره شمارۀ 3-14- طول گل آذین و برگ رقم شِش لِنگی

نگاره شمارۀ 3-15- طول گل آذین و برگ رقم وارداتی لانگرا

نگاره شمارۀ 3-16- طول گل آذین و برگ رقم وارداتی سیندری
3-2-آماده سازی فضای کار و ضدعفونی ابزار
آزمایشات در داخل محفظۀ هود لامینار و در آزمایشگاه مولکولی بخش تحقیقات گیاهپزشکی مرکز تحقیقات کشاورزی هرمزگان انجام شد. برای استخراج DNA ، کلیۀ ابزار مورد استفاده ابتدا به مدت یک ساعت در دمای℃ 121 و فشار kpa 218یا psi 15 در دستگاه اتو کلاو قرار داده شدند تا آلودگی های موجود به طور کامل از بین بروند. بدین ترتیب هر ماده قابل اتوکلاو استریل شده و ترجیحاً یک دستگاه اتوکلاو برای گندزدایی نمودن مواد PCR اختصاص داده شد.
تجهیزات و مواد مورد نیاز برای PCR جدا از سایر مواد و دستگاه های موجود در آزمایشگاه به ویژه از مواد مورد نیاز برای تجزیۀ فرآورده های PCR نگهداری شدند.
لوله های واکنش نیز در حجم ها و اندازه های مختلف وجود دارند که محصول شرکت های مختلف می باشند. برای گرفتن بهترین پاسخ، بهتر است که از بهترین نوع آن ها استفاده شود. وسایل مربوط به برداشتن حجم مشخصی از مایعات نیز از اهمیت بسیار زیادی برخوردار هستند. بهتر است که سرِ پیپت های مصرفی به منظور جلوگیری از آلودگی لولۀ پیپت با گرد و غبار هوا در ظرفی دربسته نگهداری شوند.
دستکش های یکبار مصرف در هر دفعه آزمایش به کار رود و عینک ایمنی استاندارد و روپوش آزمایشگاهی فراموش نگردد. برای جلوگیری از آلودگی محلول های ذخیرۀ موادی مانند بافرها و dNTPs ، آن ها را به مقادیر کم و مورد نیاز در ظروفی جداگانه تقسیم بندی نمود. همان طوری که قبلاً نیز ذکر شد، استفاده از هر نوع موادی برای PCR به جز مواردی که اختصاصاً برای PCR تهیه و ضمانت شده اند، می تواند سبب بروز آلودگی در واکنش گردد.
3-3- روش استخراج DNA
جهت استخراج DNA از روش دویل و دویل با کمی تغییرات به شرح زیر استفاده شد.
3-3-1- استخراج DNA و اندازه گیری کمی
برای استخراج DNA از هر رقم 5 تکرار در نظر گرفته شد. رگبرگ اصلی و حاشیه های سوخته هر برگ جدا شده و سپس 5/0 گرم از برگ هر رقم، وزن شده و در نیتروژن مایع به طور کامل در هاون های مخصوص پودر شد. سپس پودر حاصل، با قاشک های استریل شده به 5 تیوب 2
میلی لیتری منتقل شد. مقدار 800 میکرولیتر محلول CTAB+PVP از پیش گرم شده ( در دمای℃ 64 ) به هرکدام از تیوب ها اضافه شد. مقدار 10 میکرولیتر از مادۀ 2ME نیز به هر تیوب اضافه شده و تیوب ها به آرامی در جهت عمودی چندین بار حرکت داده شدند تا مواد با یکدیگر به خوبی مخلوط شوند. سپس به مدت یک ساعت در دمای℃ 65 در حمام آب گرم قرار داده شده و به فاصلۀ هر 15 دقیقه یکبار، به آرامی چند بار حرکت داده شدند تا مواد به خوبی با یکدیگر مخلوط گردند. پس از آن مقدار 800 میکرو لیتر مخلوط فنول : کلروفرم : آیزوآمیل الکل ( 1 : 24 : 25 ) به هر کدام از تیوب ها اضافه شد. سپس تیوب ها به مدت 5 دقیقه به آرامی حرکت داده شده و در دستگاه سانتریفوژ باrpm 13000 برای مدت 15 دقیقه قرار گرفتند. فاز بالایی به آرامی جدا شده و به تیوب دیگری منتقل شد. سپس مقدار 800 میکرو لیتر محلول کلروفرم : آیزوآمیل الکل به تیوب ها اضافه گردیده و دوباره در دستگاه سانتریفوژ با rpm 13000 برای مدت 15 دقیقه قرار داده شدند. فاز بالایی جدا شده و به تیوب دیگری منتقل و به آن ها آیزوپروپانول 85 % اضافه شد. (آیزوپروپانول باید از قبل سرد شده باشد و بلافاصله و بدون تأخیر به مخلوط اضافه شود، که در آزمایشگاه محل انجام پژوهش، همیشه در℃ 20- نگهداری می شود). سپس به مدت 5 دقیقه به آرامی حرکت داده شدند و برای مدت 5 دقیقه باrpm 5000 در دستگاه سانتریفوژ قرار گرفتند. پس از آن قسمت مایع موجود در تیوب به آرامی از آن خارج شد (در این مرحله باید توجه نمود که کلاف پَر مانندی که در ته تیوب ته نشین شده خارج نگردد، چون این کلاف پَر مانند حاوی DNA می باشد). سپس 100 میکرولیتر الکل اتانول 75 % به هر تیوب اضافه گردیده و باrpm 2000 برای مدت 3 دقیقه در دستگاه سانتریفوژ قرار گرفتند. این مرحله از کار جهت شستشوی DNA استخراج شده انجام می شود که باید 3 بار تکرار شود. پس از آن که مراحل شستشو انجام گرفت، اتانول را جدا کرده و تیوب ها را که حاوی یک کلاف پَر مانند به صورت لخته بودند را به حالت واژگونه روی یک کاغذ صافی قرار داده و به مدت 24 ساعت در دمای اتاق قرار داده شدند تا اتانول باقی مانده به طور کامل تبخیر شود وکلاف پرمانند حاوی DNA در تیوب خشک شود. در انتها مقدار 100 میکرو لیتر آب مقطر تزریقی به هر تیوب اضافه شده و در دمای℃ 20- قرار داده شدند.
جهت اندازه گیری کمی مقدار DNA استخراج شده، از دو روش استفاده شد: