GACACGGACC OPX-17 CCCAGCTAGA OPX-20
TGCCCGTCGT OPG-11 TTATCGCCCC OPE-12
3-4-6- مراحل انجام PCR در پژوهش پیش رو و مراحل بهینه سازی آن
3-4-6-1- آماده سازی نمونه ها و مستر میکس
جهت انجام PCR در نخستین مرحلۀ پس از استخراج DNA، مراحل PCR برای تکثیر DNA به شرح زیر صورت گرفت :
نخستین روش برای انجام PCR به شرح زیر انجام گرفت، لازم به ذکر است که نمونه های مورد استفاده با دستگاه ترموسایکلر مدل – 96 Universal Gradient PeQSTAR ساخت شرکت PeQLab (Biotechnology GmbH, UK) برای reaction های 25 تایی تهیه شدند.
ddH2O 5/17 µl
10x PCR Buffer 5/2 µl
MgCl2 3 µl
dNTPs 5/0 µl
Primer 1 µl
Taq 5/0 µl
پس از انجام الکتروفرز و عدم مشاهدۀ باند در ژل، برنامۀ PCR تغییر داده شد تا بهینه سازی PCR صورت گیرد.
پس از انجام الکتروفورز و عدم مشاهدۀ باند در ژل، به Master Mix مادۀ BSA اضافه گردید که میزان آن به صورت زیر بود. به ازای هر 1000 میکرو لیتر از MM مقدار 10 میکرو لیتر BSA اضافه گردید. سپس با استفاده از روش جدید ( اضافه کردن مادۀ BSA ) دوباره PCR با برنامۀ Gradient تکرار شد که پس از انجام الکتروفورز و عدم مشاهدۀ باند در ژل، برنامۀ PCR جهت بهینه سازی تغییر داده شد.
با برنامۀ جدید و همراه با اضافه کردن BSA به مخلوط اصلی، بازهم باندی مشاهده نشد. پس از انجام الکتروفورز و عدم مشاهدۀ باند، علاوه بر BSA مادۀ DMSO هم به مخلوط اصلی اضافه گردید که میزان آن به صورت زیر می باشد: به ازای هر 10 میکرو لیتر از مخلوط اصلی، مقدار 5/0 میکرو لیتر از مادۀ DMSO اضافه شد. مقدار محاسبه شده برای DMSO در پایان باید از میزان آب کل مخلوط اصلی کاسته گردد. پس از اضافه کردن DMSO به مخلوط اصلی، دوباره برنامۀ PCR قبلی تکرار شد و باز هم پس از انجام الکتروفورز، باندی مشاهده نگردید. سپس برای بهینه سازی چرخۀ PCR از غلظت های مختلف DNA استفاده شد که به شرح زیر می باشند: 3/1، 4/1، 5/1و برنامۀ PCR بر طبق آخرین برنامه اجرا گردید. جهت انجام الکتروفورز از ژل با غلظت 2% استفاده شد. برای بهبود کیفیت باندها و همچنین مورد آزمایش قرار دادن غلظت ژل آگاروز، محصولات PCR آخر،دوباره الکتروفورز شدند ولی این بار با غلظت 4/1 % و پس از انجام الکتروفورز،یکبار دیگر رنگ آمیزی در تانک رنگ به مدت 30 دقیقه انجام شد و پس از آن 15 دقیقه آبکشی گردید. باندهای حاصل از این مرحله در نگارۀ شمارۀ 6 قابل مشاهده می باشند. جهت بهینه سازی کیفیت باندهای گرفته شده در آخرین PCR، سه غلظت یاد شدۀ DNA در بالا با مقادیر مختلف MgCl2 به شرح زیر مورد آزمایش دوباره قرار گرفتند:
MgCl225/3 µl I
MgCl2 8/2 µl II
MgCl2µ 6/2 l III
محصولات این PCR با دو غلظت ژل آگاروز به مقادیر 1% و 2/1% تحت الکتروفورز قرار گرفتند.
با توجه به عدم مشاهدۀ باندهای مناسب از محصولات PCRهای اخیر، جهت بهینه سازی باندهای گرفته شده از آخرین PCR، برنامۀ جدیدی به دستگاه داده شد و برای تهیۀ مخلوط اصلی از سه غلظت مختلف DNA که قبلاً استفاده شده بود نیز استفاده گردید. در برنامۀ جدید PCR، مدت زمان اتصال آغازگرها از 20 ثانیه به 30 ثانیه افزایش داده شد.
باند مناسبی از این PCR گرفته نشد. پس از آن همین برنامۀ PCR ولی این بار با 5 غلظت متفاوت از DNA الگو، یک بار دیگر PCR تکرار شد. غلظت های استفاده شده برای DNA الگو در این PCR به شرح زیر بودند: