1، 2/1، 3/1، 4/1، 5/1، 6/1 و پس از انجام الکتروفورز، هیچ باندی از این مرحله مشاهده نگردید. سپس برای بهینه سازی چرخۀ PCR، یک بار دیگر از یکی از برنامه های قبلی PCR و این بار با سه غلظت متفاوت از DNA الگو استفاده شد. الکتروفورز محصولات این چرخۀ PCR یک بار با ژل 7/0% انجام شد. به دلیل عدم وضوح کافی باندها، مرحلۀ الکتروفورز یک بار دیگر با ژل 1% انجام شد. پس از مشاهدۀ باندها، برای بهبود کیفیت باندهای گرفته شده، ژل مورد نظر یک بار در تانک رنگ حاوی اتیدیوم بروماید به مدت 30 دقیقه قرار داده شد و سپس به مدت 15 دقیقه آبکشی صورت گرفت.
برای بهینه سازی نهایی چرخۀ PCR، و بهبود کامل کیفیت باندها، از یک برنامۀ جدید برای PCR استفاده شد که به شرح زیر می باشد. جهت انجام این چرخۀ PCR و با توجه به نتایج گرفته شده از غلظت های متفاوت استفاده شده برای DNA الگو، در این مرحله از سه غلظت 3/1، 4/1، 5/1 استفاده شد و پس از انجام الکتروفورز، که با ژل 1% صورت گرفته بود، یکبار عکسبرداری بلافاصله پس از الکتروفورز انجام شد که نتایج آن در نگارۀ شمارۀ 3-3 قابل مشاهده می باشد و یک بار هم عکسبرداری، پس از رنگ آمیزی ژل در تانک رنگ به مدت 15 دقیقه و سپس آبکشی به مدت 15 دقیقه انجام شد که نتایج این قسمت نیز در نگارۀ شمارۀ 3-4 قابل بررسی می باشند.
94℃ ‘1
35 ℃ ‘1
72 ℃ ‘2
94℃ “10
40 ℃ “20
72 ℃ ‘2
72 ℃ ‘5

نگارۀ شمارۀ 3-17- عکسبرداری پس از انجام الکتروفورز

نگارۀ شمارۀ 3-18- عکسبرداری پس از رنگ آمیزی در تانک اتیدیوم بروماید
با توجه به نتایج به دست آمده از کلیۀ مراحل انجام شده برای بهینه سازی چرخۀ PCR، دستور کار کلی برای انجام PCR در پژوهش پیشرو، بر اساس برنامۀ ذکر شده در بالا، با غلظت DNA الگو برابر با 3/1 ، ژل الکتروفورز با غلظت 1%، مدت زمان الکتروفورز 1 ساعت با ولتاژ 100 و رنگ آمیزی پس از اتمام الکتروفورز در تانک رنگ به مدت 30 دقیقه و سپس آبکشی به مدت 3 دقیقه مشخص گردید. لازم به ذکر است که در زمان تهیۀ ژل، مقدار اتیدیوم بروماید اضافه شده به مخلوط ژل، در کلیۀ آزمایش ها، 5/5 میکرو لیتر در هر 100 میلی لیتر بوده است.
3-5- ژل الکتروفورز
الکتروفورز مقداری از فرآورده های PCR بر روی ژل آگارز یا ژل پلی آکریل آمید، رنگ آمیزی ژل با اتیدیوم بروماید (یعنی یک مادۀ رنگی که دارای خاصیت فلورسانس می باشد) و آن گاه مشاهدۀ ژل در زیر نورU.V یکی از ساده ترین روش ها برای تشخیص و بررسی فرآورده هایPCR است.
پس از رنگ آمیزی و با تابش نور ماوراء بنفش به ژل، مشاهدۀDNA در ژل امکان پذیر
می گردد. حال می توان ژل را عکس برداری نمود تا نتیجۀ آزمایش برای همیشه ثبت گردد .
نشانگرهای اندازه ای (وزنی) و فرآورده های PCR مربوط به کنترل آزمایش را می توان در چاهک های جانبی ژل قرار داد، تا امکان تعیین دقیق اندازۀ قطعات تکثیر شده فراهم آید.
روش دیگر برای مشاهدۀ باندهایDNA در یک ژل، رنگ آمیزی آن با نقره می باشد که در نتیجۀ آنDNA مستقیماً و بدون نیاز به پرتو تابیU.V مشاهده می گردد.
در این پژوهش از تکنیک رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید استفاده شد که نحوۀ تهیۀ ژل آگاروز به صورت زیر بوده است: