معمولأ ذرات کوچک سوبسترا سطح وسیعی را برای حمله میکروبی فراهم می کنند. کوچکی بیش از حد ذرات سوبسترا احتمال تراکم میکروبی را زیاد می کند که خود مانع ازتنفس میکروب ها یا هوادهی شده و نتیجه آن کاهش رشد است.[25]
اکثر روش های تخمیر در بستر جامد،فرایند های ناپیوسته هستند اگرچه تلاش هایی در جهت ارتقاء آنها به سیستم های نیمه پیوسته وپیوسته صورت گرفته است.برخی از فرایندها نیازی به بیورآکتور ندارند و از طریق بخش بستربر محیط مناسب صورت میگیرد.فرآیندهایی که برای آنها از ظروف تخمیر استفاذه می شود،نوسانات زیادی دارند[24]

فصل دوم:
ادبیات و سوابق تحقیق
2-1- مروری بر پیشینه تحقیق
در رابطه با جداسازی باکتری های مولد آنزیم ال آسپارژیناز در ایران پژوهشی برای جداسازی باکتری های هالوفیل مولد ال آسپارژیناز از دریاچه مهارلو توسط ابراهیمی نژاد و همکاران( 2011) صورت گرفته است.
در پژوهش صورت گرفته که برای سنجش تاثیر شرایط هالوفیلیک انجام شده است مشخص گردید که Bacillus sp. BCCS 034 بالاترین میزان تولید آنزیم خارج سلولی IU/ml) 64/1 (را داشته است[24].
Ceder درسال 1968 گزارش داد که ال آسپارژیناز با یک سرعت ثابت به وسیله E.coli تحت شرایط بی هوازی سنتز می شود[27].
در مورد شناسایی و جداسازی باکتری های مولد ال آسپارژیناز پژوهشی توسط Audipudi و همکاران در هند( 2013) انجام شده است که در آن باکتری های مولد ال آسپارژیناز از خاک های مانگرویی جداسازی و شناسایی شده اند. این باکتری ها بیشتر متعلق به جنس باسیلوس و سودوموناس بوده اند [28].
پژوهشی با هدف جداسازی میکروارگانیسم های مولد ال آسپارژیناز از گیاه Ocimum sanctum. L توسط Karnataka (2010) صورت گرفته است. در این تحقیق تمامی میکروارگانیسم های جداسازی شده قادر به رشد در محیط حاوی آسپارژین به عنوان منبع نیتروژن بودند [29].
Yasser در سال 2002 بر روی تولید ال آسپارژیناز به وسیله Pseudomonas aeruginosa بر روی محیط کشت جامد کار کرد و همچنین بر روی تکامل و بهینه سازی محیط کشت با تاثیر فاکتورهای مختلف تحقیق کرد[30].
در تحقیق دیگری که در رابطه با جداسازی باکتری های مولد ال آسپارژیناز توسط Kambleو همکاران( 2012)از خاک نمکی و آب صورت گرفته است محیط کشت خاصی برای جداسازی این باکتری ها طراحی شده و بیشتر ایزوله ها مربوط به جنس Serratia ، Basilus،Aeromonas Proteus بوده اند. E.coliو Pseudomonas aeroginosa نیز در میان این ایزوله ها وجود داشته است [18].
. Younes Ghasemi در سال (2008) بر روی تغلیظ اجزای اصلاح شده محیط کشت مختلف و منابع کربن مختلف که برای بهینه کردن محیط کشت استفاده شده تحقیق نموده وهمچنین بر روی جداسازی ال آسپارژیناز در E.coli مطالعه کرده است [31].
در پژوهش صورت گرفته توسط Bashaدر سال 2009 Actinomycete ها برای سنجش فعالیت آنزیمی غربال گری شدند.[32].
جداسازی ال آسپارژیناز از منابع باکتریایی پژوهش دیگری است که توسط Kushwaha و همکاران(2012) صورت گرفته است. در این پژوهش تشکیل رنگ قرمز اطراف کلنی ها به منزله تولید ال آسپارژیناز است. در این پژوهش تخمیر به حالت shake flask انجام شده است. تولید آنزیم با بررسی تاثیر pH و ممانعت کننده ها و محرک ها مورد ارزیابی قرار گرفته است. pH بین 7-9 ودمای 37-50 درجه سانتی گراد بالاترین میزان تولید آنزیم را داشته اند [33].
در زمینه جداسازی باکتری های مولد ال آسپارژیناز از خاک در هند Padhyay و همکاران( 2012) با استفاده از محیط کشت اصلاح شده M9 باکتری های مولد ال آسپارژیناز را با بهره گیری از حالت تخمیر غوطه ور جداسازی کرده اند. در این پژوهش 5 باکتری با فعالیت بالای آنزیمی شناسایی شده است. [34]
در مورد تخلیص و تولید آنزیم ال آسپارژیناز پژوهشی توسطRoberts (2000) صورت گرفته است که در آن بهترین محیط سوبسترا برای تولید آنزیم corn steep که در آن گلوتامیک اسید، ال متیونین و لاکتیک اسید وجود داشت بالاترین تولید آنزیم توسط E.coli صورت گرفته است [35].
تولید آنزیم ال آسپارژیناز در اکتینومایست ها هم مورد بررسی قرار گرفته است . در پژوهش صورت گرفته توسط Dharmaraj (2011) تولید ال آسپارژیناز در Streptomyces noursei MTCC 10469 که از نوعی اسفنج دریایی جداسازی شده بود مورد بررسی قرار گرفته است. دراین پژوهش با استفاده از محیط کشت ISP به جداسازی استرپتومایسس اقدام شده و روش تخمیر غوطه ور برای بهینه سازی مورد استفاده قرار گرفته است . آنزیم با بهره گیری از رسوب توسط آمونیوم سولفات به هموژنیسیته نزدیک به خلوص رسید و با استفاده از ژل فیلتراسیون روی ستون سفادکس 100 دیالیز شد.وزن مولکولی آنزیم حدود 120 کیلودالتون بود. pHبهینه 8 و دمای مناسب 30 درجه سانتی گراد به مدت 35 دقیقه برای آنزیم فوق به ثبت رسید [36].
علاوه بر باکتری ها و اکتینومایست ها در رابطه با جداسازی قارچ های مولد ال آسپارژیناز هم پژوهش هایی انجام شده است. به عنوان مثال در تحقیق انجام شده توسط Patro و همکاران(2011) قارچ های مولد ال آسپارژیناز جداسازی شده تحت شرایط Batch از لحاظ تولید ال آسپارژیناز مورد ارزیابی قرار گرفتند. از میان 66 ایزوله 7 تا با فعالیت بسیار بالا مشاهده شدند. یکی ازایزوله ها در محیطی با فروکتوز به عنوان منبع کربن و پرولین به عنوان منبع نیتروژن فعالیت قابل قبولی از خود نشان داد [37].
در رابطه باتولید، تخلیص و تعیین میزان آنزیم ال آسپارژیناز خارج سلولی درگونه های باسیلوس جداسازی شده از خاک پژوهشی توسطMoorthy و همکاران (2010) انجام شده است که در آن تخمیر به روش غوطه ور صورت گرفته است. دو منبع کربن یعنی گلوکز و مالتوز مورد استفاده قرار گرفت که گلوکز شرایط مناسب تری برای تولید آنزیم ایجاد می کرد. آنزیم با رسوب توسط آمونیوم سولفات تخلیص شد و با دیالیز درجه خلوص افزایش یافت. تخلیص نهایی با کروماتوگرافی تعویض یونی انجام شد. pH بهینه 7 ودمای 37 درجه بالاترین میزان تولید آنزیم را در پی داشتند [38].
در پژوهش دیگری که در رابطه با خالص سازی ال آسپارژیناز Erwinia توسط Kamble و همکاران (2009)انجام شده است مشخص شد که بالاترین فعالیت آنزیمی در 8/6 pH=و دمای 35 درجه سانتی گراد با ال آسپارژین به عنوان سوبسترا صورت گرفته است. هم چنین مشخص گشت که مشتقات دی پیریمیدین باعث افزایش فعالیت آنزیم می شوند [39].
پژوهش دیگری در زمینه تخلیص ال آسپارژیناز از Serratia marcescens توسط Boydو همکاران(2001) انجام شده است که در آن تاثیر pH و دما بر روی تولید آنزیم سنجیده شده و سپس تاثیر آنزیم تخلیص شده بر روی موش با آنزیم به دست آمده از E.coli مورد مقایسه قرار گرفته است و مشخص شد که ال آسپارژیناز سراشیا با دوز کمتری قادر به مهار تومور است.[40]
در زمینه ارزیابی فعالیت آنزیمی ال آسپارژیناز Nath و همکاران،(2009) با بهره گیری از Hplcبه ارزیابی فعالیت آنزیمی ال آسپارژیناز جداسازی و تخلیص شده از E.coli پرداخته اند. در این پژوهش از ستون (Phenomenex Luna C(18 استفاده شده است [41].
در پژوهش دیگری که در زمینه سنجش ارزیابی فعالیت آنزیمی ال آسپارژیناز توسط Ylikangasa و همکاران (2000)صورت گرفته است آنزیم استخراج شده از Erwinia chrysanthemi با روش فلورومتریک مورد ارزیابی قرار گرفته است [42].
در رابطه با بهینه سازی شرایط فرمانتاسیون برای تولید آنزیم ال آسپارژیناز درsp .Staphylococcus تحقیقی توسط Praksham و همکاران(2006) صورت گرفته است. در این تحقیق بهینه سازی از لحاظ شرایط غذایی و شرایط فیزیولوژیک و همچنین میکروبی صورت گرفته است. در میان عوامل مورد بررسی زمان انکوباسیون، pH و میزان تلقیح به صورت عوامل مجزا و به تنهایی بالاترین تاثیر را داشتند. آشفتگی و هوادهی هم به صورت دو عامل همزمان بالاترین تاثیر را از خود برجای گذاشتند [43].