اساس ژنتیکی بسیاری از نشانگرهای مورفولوژیک هنوز مشخص نشده است(نقوی و همکاران،1386).
بررسیهای مناسب و خوبی روی گوناگونی ارقام انبۀ هندی با استفاده از نشانگرهای مورفولوژیک صورت گرفته است(برنز و پرایاگ، 1921 ؛ موخرجی ، 1953؛ نِیک و گانگولی ، 1950؛ گانگولی و همکاران، 1957؛ راجان و همکاران ، 1999). به هر حال بررسی گوناگونی ژنتیکی بر پایۀ خصوصیات مورفولوژیکی، محدودیتهای زیادی دارد. خصوصیات مورفولوژیکی به طورمعمول از نظر تعداد محدود هستند و مسیرهای پیچیدۀ توارثی دارند و تحت تأثیر شرایط محیطی قرار میگیرند( کاریهالو و همکاران ،2003). در ایران رضازاده و همکاران (1375)، ارقام برتر انبه را جمع آوری و با استفاده از نشانگرهای مورفولوژیک، آنها را طبقه بندی و نام گذاری کردند.
2-4-3-نشانگرهای بیوشیمیایی
نشانگرهای بیوشیمیایی، پروتئینهایی هستند که به وسیلۀ بیان ژن ساخته میشوند. این پروتئینها میتوانند جدا شده و به وسیلۀ رنگ آمیزی و الکتروفورز، شناخته شوند. آیزوزایمها به عنوان نشانگرهای بیوشیمیایی در جنبههای اصلی بهنژادی گیاهی و ژنتیک به عنوان نشانگرهای ژنتیکی تقریباً خنثی به طور کاملاً موفق استفاده شده اند. متابولیتهای الکتروفورزی آنها نتیجۀ اندازهها و شکلهای مولکولهای آنزیمی مختلف هستند و گوناگونی آنها یک شاخص خوب برای گوناگونی ژنتیکی است(شانون ،1968). آیزوزایمها به طور نزدیکی به تولیدات ژنی، مربوط هستند(سوست و تورِس ،1981). آیزوزایمها، شکلهای مختلف مولکولی از یک آنزیم مشابه که واکنش مشابهی را کاتالیز میکنند، میباشند(چاولا ،2000). تاکنون در انبه تحقیقاتی با استفاده از آیزوزایمها صورت گرفته است که به شرح زیر میباشند: ارزیابی گوناگونی ژنتیکی در انبه با استفاده از نشانگرهای آیزوزایمی(گان و همکاران ،1981)، شناسایی لوکوسهای مختلف با 17 آللومورف در 41 رقم(دِگانی و همکاران ،1990)، شناسایی دورگههای انبۀ ناشی از دورگ گیری(جینتاناوُنگز و چانگتراگون ،2000).
گان و همکاران در 1981 برای اولین بار، استفاده از آیزوزایم ها را برای تفسیر گوناگونی در ارقام انبه گزارش کردند. پس از آن، دِگانی و همکاران در 1990 در خلال کار روی آنزیمهای مختلف شامل: GPI(گلوکز-6-فسفات ایزومراز )(EC.5.3.1.9)، TPI(تریوزفسفات ایزومراز )(EC.5.3.1.1)، LAP(لوسین آمینوپپتیداز )(EC.3.4.11.1)، IDH(ایزوسیترات دهیدروژناز )(EC1.1.1.42)، PGM(فسفوگلوکوموتاز )(EC2.7.5.1) و ACO(1-آمینوسیکلوپروپان-1-کربوکسیلیک اسید اکسیداز )(EC.4.2.1.3)، تعداد 6 لوکای را با 17 آللومورف در 41 رقم انبۀ مشتق شده از درختان خود و دگرگرده افشانی شده، شناسایی کردند. همچنین امکان پیدا کردن تفاوت در نسب ارقام انبه نیز وجود داشت. اِشنِل و نایت در 1992، از 5 آیزوزایم شامل IDH، LAP، GPI، PGM و TPI استفاده کردند تا دانهالهای مشتق شده از رویانهای جنسی از ارقام چند رویانی را تفکیک کنند. دِگانی و همکاران در 1992، بعداً دو ناحیۀ جداگانۀ فعالیت PGI(فسفوگلوکوایزومراز )، یعنی PGI1 و PGI2 را نشان دادند و پیشنهاد کردند که PGI2 به وسیلۀ 4 آلل کنترل میشود. سپس، جینتاناوُنگز و چانگتراگون در 2000، سیستمهای آنزیمی مختلفی را برای شناسایی دورگههای انبه و دورگههای واقعی ناشی از دورگ گیری با استفاده از 11 سیستم آیزوزایمی، استفاده کردند.
2-4-4-نشانگرهایDNA
یک نشانگر مولکولی یک توالی DNA است که به آسانی پیدا میشود و توارث آن به سادگی قابل مشاهده است(چاولا،2000). استفاده از نشانگرهای مولکولی بر پایۀ وقوع چند شکلی طبیعی DNA میباشد. یک نشانگر باید چند شکل باشد که به این علت است که باید در
شکلهای مختلفی وجود داشته باشد که کروموزومی که ژن جهش یافته را حمل میکند بتواند از کروموزومی که ژن طبیعی را حمل میکند و آنها به وسیلۀ نشانگر حمل میشود، تشخیص داده شود. چند شکلی ژنتیکی به عنوان وقوع همزمان یک ویژگی در یک جمعیت مشابه از دو یا چند ژنوتیپ یا گونۀ ناپیوسته تعریف میشود. مطابق با نظرچاولا در 2000، یک نشانگر مولکولی باید تعدادی مشخصات مطلوب داشته باشد، به عنوان مثال: باید چند شکل باشد، قابل تکثیر بوده وبارها از طریق ژنوم توزیع شده باشد. نشانگرهای مولکولی برای توضیح روابط فیلوژنتیکی در بسیاری از گیاهان مورد استفاده قرار گرفتهاند(نیکولوسی و همکاران ،2000). نشانگرهای DNA مختلفی در انبه مورد استفاده قرار گرفته اند تا ویژگیهای پلی ژنی و مونوژنی آن مورد مطالعه قرار گیرند. نظر به اینکه انبه یک میوۀ گرمسیری است، جداسازی میزان کافی DNA ژنومی برای استفاده در تکنولوژی نشانگرهای مبتنی بر PCR، بارها مشکلات شدیدی را به وجود میآورد که مربوط به وجود بازدارندههایی مثل پلی ساکاریدها که مانع فرآوری آنزیمی DNA میشوند یا فنولها که به عنوان بازدارندههای واکنشهای PCR هستند(رامیرِز و همکاران ،2004). پروتوکل تثبیت شدۀ CTAB به وسیلۀ دویل و دویل ، محصولات الگوی DNA بسیار خوبی برای انبه جهت تکثیر PCR به وجود آورد(رامیرِز و همکاران، 2004). اخیراً گوماتی و همکاران در 2005، یک روش ساده و کارا برای جداسازی DNA از بافتهای سالم و تغییرشکل یافتۀ انبه (M. indica L.) گزارش
کردهاند.
2-4-5-نشانگرهای RFLP
نخستین نشانگرهای مولکولی DNA از این قبیل که مورد استفاده قرار گرفتند، نشانگرهای ژنتیکی مبتنی بر قطعات تولید شده به وسیلۀ هضم محدود شده – تفاوت طول قطعات حاصل از هضم (RFLP) بودند(چاولا،2000). RFLP نخستین تکنولوژیای بود که تشخیص چند شکلی در سطح توالی DNA را فعال کرد. در این روش، DNA به وسیلۀ آنزیم محدود کننده هضم میشود که DNA را در نقاط ویژهای برش میدهد، الکتروفورز میشود، بلات میشود و به وسیلۀ یک کلونِ Labled شده، شناسایی میشود(چاولا،2000). ایادتونگ و همکاران در b1999، رابطۀ فیلوژنتیک در جنس Mangifera را به وسیلۀ RFLP و تکثیر DNA کلروپلاستی(cpDNA) تأیید کردند.
آنها توزیع جغرافیایی تعدادی از گونههای Mangifera را در تایلند تأیید کردند. اگرچه 5 گونۀ M.gracilipe,f.، M.lagenifera، M.longipes، M.longipetiolata و M.quadrifida در حین نمایان ساختن مردود شدند، چهار گونۀ M.griffithi، M.oblongifolia، M.gallina و M.macrocarpa از طریق RFLP و cpDNA شناسایی شدند. تأیید شد که M.indica و M.sylvatica بسیار به هم نزدیک بودند. به علاوه آنها پیشنهاد کردند که جنس Mangifera باید دوباره بر پایۀ تحلیلهای مولکولی طبقه بندی شود، برخلاف طبقه بندیای که کاستِرمن و بُمپارد در 1993 بر پایۀ نشانگرهای ریخت شناسی انجام داده بودند. چانوونگز و همکاران در 2000 با استفاده از نشانگرهای AFLP و RFLP یک نقشۀ مولکولی ارقام Alphonso و Palmer را ایجاد کردند.
به طور مشابه، راویشانکار و همکاران در 2004، نسبت ژنتیکی میان 10 رقم تک رویانی و چند رویانی انبه را که هر کدام به طور سنتی در غرب ساحل جنوبی هند پرورش یافته بودند را با استفاده از تحلیلهای RFLP برای DNA کلروپلاستی و DNA ژنومی بررسی کردند. 8 گونۀ انبه از هر کدام از این گروهها برای تجزیۀ DNA کلروپلاستی با RFLP استفاده شدند. دادههای حاصل از نشانگرهای RAPD و نشانگرهای RFLP برای DNA کلروپلاستی برای تجزیۀ کلاستر و (PCA) به طور مجزا استفاده شدند. تجزیۀ دندروگرام دادههای RAPD و RFLP برای DNAکلروپلاستی، به طور واضحی این ارقام را به دو گروه مبتنی بر رویان شامل تک رویانی و چند رویانی تقسیم کردند. در هر دو تحلیل DNA ژنومی و RFLP برای DNA کلروپلاستی، گروه بندی ارقام بر پایۀ انواع رویانهای آنها، نشان میدهد که انواع تک رویان و چند رویان ارقام انبۀ هندوستانی، مبنای ژنتیکی متفاوتی دارند. این نتایج پیشنهاد میکنند که انواع چند رویان ممکن است از دیگر
قسمتهای آسیای جنوب شرقی معرفی شده باشند و بعید است که از هندوستان منشأ گرفته باشند.
از جمله مشکلاتی که بر سر راه استفاده از نشانگرهای RFLP وجود دارند میتوان به طور مختصر به موارد زیر اشاره کرد: دشواری، پیچیدگی و وقتگیر بودن آن: تهیه کتابخانههای ژنومی یا cDNA به عنوان مخزن کاوشگر، نگهداری آنها، نشاندار کردن آنها، استخراج مقادیر زیاد DNA، انجام الکتروفورز، انتقال ساردن، دورگ گیری، خودپرتونگاری و … مراحلیاند که در مجموع پیچیده و وقت گیرند. RFLP ژنومهای بزرگ نیازمند کاربرد مواد پرتوزا یا روشهای پیچیدهتر و گرانتر بیوشیمیایی است. RFLP نیازمند نگهداری ریزسازوارهها به منظور تهیۀ کاوشگر است که خود بر پیچیدگی این روش میافزاید. هزینۀ اولیۀ زیاد و هزینۀ نسبتاً زیاد نگهداری کاوشگرها و کاربرد
آنها، RFLP را گران کرده است. نیاز به مقدار نسبتاً زیادی DNA (در حد یک یا چند میکروگرم) از محدودیتهای دیگر روش RFLP است .به طوری که دهها میکروگرم از DNA برای هر فرد به منظور تجزیۀ ژنوم مورد نیاز است، در صورتیکه در روشهای مبتنی بر PCR تنها چند نانوگرم کافی است. از محدودیتهای نشانگرهای RFLP این است که در گونههای بسیار نزدیک به همدیگر این نوع نشانگرها آللهای مشابهی را نشان میدهند.
2-4-6-تعداد متفاوت ردیف های تکراری (VNTRS)
آداتو و همکاران در 1995، الگوهای انگشت نگاری DNA را از بعضی از ژنوتیپهای انبه با استفاده از شناساگرهای مولتی لوکوس ریزماهواره ای، تجزیه کردهاند. آنها همچنین تجزیۀ ژنتیکی نتاج حاصل از تلاقی ” Tommy Atkins x Keitt ” را انجام دادند و 6 باند از والدین، چند شکلی را نشان داد و میانگین فراوانی انتقال، 65 و برای باندهای ویژۀ مادری و پدری، 81% بود.
2-4-7-نشانگرهای RAPD
نشانگرهای DNA چند شکلی تکثیر شدۀ تصادفی (RAPD) بر تکثیر با استفاده از آغازگرهای اختیاری تکیه دارند(ویلیامز و همکاران ،1990؛ وِلش و مَک لِلَند ،1990). RAPD در تهیۀ
نقشههای ژنوم گیاهی استفاده شده است (فولاد و همکاران ،1993). تجزیۀ RAPD نسبت به تجزیۀ RFLP در تشخیص گونه، کاراتر است(سانتوز و همکاران ،1994؛ راجاپاکسه و همکاران ،1995). آغازگرهای اصلاح شده به وسیلۀ یک تک نوکلئوتید، نیمرخهای مختلفی تولید میکنند. در نتیجه، فن RAPD میتواند چند شکلیهای بین ژنوتیپهای بسیار نزدیک را گسترش دهد. شیوۀ تکثیر، یک میزان بسیار کم از DNA ژنومی را نیاز دارد و تولیدات تکثیر شده می توانند مستقیماً روی ژل آگاروز، رنگ آمیزی شده با اتیدیوم بروماید مشاهده شوند(دِنگ و همکاران ، 1995). نشانگرهای ژنتیکی مبتنی بر واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)، کاربرد گسترده ای در بهنژادی گیاهی پیدا کرده اند(کیجاس و همکاران ، 1995).