معرف ( D
محلول 5/1 مولار تری کلرو استیک اسید (TCA)
برای تهیه محلول 1.5 مولار TCA ، 08/245 گرم TCA در 1000 میلی لیتر آب مقطر حل شد.
معرف E (معرف نسلر)
برای تهیه معرف نسلر 5/45 گرم HgI2 ،35 گرم KI و 1123 گرم KOH را در یک لیتر آب مقطر حل شد.
معرف F)
محلول آنزیمی استخراج شده
3-11- نحوه ی سنجش فعالیت آنزیم 12 آزمایش
برای خواندن جذب نوری 12 آنزیمی که استخراجشد 12 لوله انتخاب کرده و آن ها را از شماره 1 تا 12 نام گذاری نمودیم. ابتدا به هر لوله یک میلی لیتر معرف A افزوده و سپس به هر 12 لوله معرف B اضافه نمودیم. بعد 9/0 میلی لیتر آب مقطر افزودیم. سپس به هر کدام از لوله ها یکی از آنزیم ها را افزودیم مثلا به لوله T9آنزیم استخراج شده شماره یک را اضافه نمودیم به همین ترتیب به هر 12 لوله آنزیم های استخراج شده را افزودیم. بعد 30/2 میلی لیتر آب مقطر اضافه کرده و مخلوط می نماییم. دستگاه اسپکتروفوتومتر را روی طول موج 436 تنظیم کرده و با بلانک مربوط به تست ها صفر کرده و طول موج ها را قرائت .

شکل3- 2- نشان دهنده لوله های حاوی محلول نهایی مورد آزمایش یا test group است.
3-11-1- تخمیر در بستر جامد طی بهینه سازی تولید با روش RSM:
داخل ارلن های 250 میلی لیتری 10 میلی لیتر محلول نمکی ریخته شد. منابع کربن و نیتروژن انتخابی در روش Plackett- Burman (سبوس برنج و آسپارژین) در مقادیر بهینه (وزنی-وزنی بر اساس وزن سوبسترا)اضافه شد. ارلن ها در 121 درجه سانتی گرادبه مدت 15 دقیقه استریل وسپس از محیط پیش کشت به میزان 2 میلی لیتربه ارلن ها اضافه گردید و بر اساس برنامه طراحی شده توسط نرم افزاردر بستر های آزمایشی 30 گانه تولید آنزیم ارزیابی گردید.
3-11-2- اثر پارامترهای مختلف بر تولید آنزیم در بستر جامد
محیط های کشت بستر جامد در میزان غلظت های سبوس برنج( 5/0،1، 5/1 ، 2 ،5/2 % وزنی-وزنی)و میزان غلظت آسپاراژین (1/0 ،3/0 ،5/0 ،7/0 ،9/0% وزنی-وزنی)و دوره های زمانی (24،48،72،96،120ساعت) و دمای (20،25،30،35،40 درجه سانتی گراد) مورد بررسی قرار گرفتند.
3-11-3- استخراج آنزیم
وقتی هر ارلن نمونه زمان مورد نظر را سپری کرد آن را برداشته و 45 میلی لیتر به آن بافر فسفات افزوده شد و سپس به مدت 30 دقیقه داخل shaker گذاشته شد و بعد از با کاغذ صافی رد فیلتر گردید. عصاره حاصل ازفیلتراسیون به مدت 20 دقیقه با دور6000 سانتریفوژ گردید و از سوسپانسیون رویی به عنوان محلول خام حاوی آنزیم استفاده شد
3-11-4- سنجش فعالیت آنزیم
به هر لوله آزمایش ابتدا یک میلی لیتر معرف A بعد 1/0 میلی لیتر معرف B بعد 9/0 میلی لیتر آب مقطر و بعد 1/0 میلی لیتر از محلول آنزیم ریخته شد و سپس به مدت 30 دقیقه در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی گراد گرمخانه گذاری شد. بعد 1/0 میلی لیتر معرف D اضافه شد(با افزودن معرف D(TCA) واکنش آنزیمی پایان می پذیرد). بعد 30/2 میلی لیتر آب مقطر افزوده و بعد 5/0 میلی لیتر معرف E اضافه شد. جذب های نوری در 436 نانومتر مورد ارزیابی قرار گرفت.یک واحد فعالیت آنزیمی مقدار آنزیمی است که یک میکرومول آمونیاک را در مدت زمان یک دقیقه در دمای 37 درجه سانتی گراد آزاد کند.مقدار آمونیاک حاصله بر اساس منحنی استاندارد تعیین شد [46] .
3-12- روش تهییه فسفات بافر:
برای تهیه فسفات بافرM 01/0PH=7.2 مولار اول دو محلول تهیه شد که یکی را A و دیگری را B نامیدیم.
محلول A) NaH2PO4.H2O 0.2M
برای تهیه محلول A 8/27‌ گرم از NaH2PO4.H2O در یک لیتر آب مقطر حل شد.
محلول ‌B) 0.2M Na2HPO4.7H2O
برای تهیه محلول B 6/52 گرم از Na2HPO4.7H2O در یک لیتر آب مقطر حل شد.
28 میلی لیتر از محلول A را با 72 میلی لیتر از محلول B مخلوط کرده و حجم آن را به 200 میلی لیتر می رسانده شد. وقتی هر ارلن نمونه زمان مورد نظر را سپری کرد برداشته و 45 میلی لیتر به آن بافر فسفات افزوده شد و سپس به مدت 30 دقیقه داخل shaker گذاشته و بعد از کاغذ صافی رد شد و سپس به مدت 20 دقیقه در 6000 دور سانتریفوژ شد و آنزیم استخراج شد.