واکنش تکثیر ژن مورد نظر در 30 چرخه انجام گرفت. پس از پایان واکنش تکثیر، مقدار 5 μl از نمونه بر روی ژل آگاروز 1 درصد برده شد تا کیفیت قطعات ژنی پس از تکثیر مورد ارزیابی قرار گیرد .سرانجام محصول PCR توالی یابی شد و تشابه توالی مورد نظر با استفاده از نرم افزار Blast مورد بررسی قرار گرفت.
3-4- محیط پیش کشت:
از محیط کشت M9 بدون فنل رد و آگار به عنوان مایه تلقیح استفاده گردید.پس از تهیه پیش کشت، با لوپ یک کلنی از باکتری هایی که مدت 24 ساعت از کشت آنها در محیط M9 سپری شده است برداشته و داخل مایع کشت داده شد و برای 24 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد قرار داده شد.[48]
3-5- روش بهینه سازی و طراحی آزمایش
این طراحی در 2 مرحله و با دو روش متفاوت با استفاده از نرم افزار minitab انجام شد:
الف- طراحی آزمایش Plackett-Burman
ب- طراحی آزمایش Response surface methodology(RSM)
3-5-1- طراحی آزمایش Plackett-Burman
با استفاده از طراحی Plackett-Burman ابتدا یک بررسی مقدماتی برای تعیین بهترین منبع کمکی کربن(پودر سبوس برنج، ساقه برنج، پودر سبوس گندم و ساقه گندم) و نیتروژن ( پپتون، عصاره مخمر، آسپاراژین، تریپتون) به عنوان القا کننده تولید آنزیم انجام شد. بدین ترتیب مهمترین فاکتورهای تأثیرگذار بر تولید آنزیم غربالگری می گردد. براین اساس هر فاکتور در2 سطح 1- (سطح پائینی) و 1+ (سطح بالایی) مورد بررسی قرار گرفت.
بدین ترتیب بر اساس جدول های شماره 3- 5و 3- 6 طراحی انجام و غلظت ها انتخاب شد.بدین ترتیب تأثیر متغیرها به شکل خطی یا غیر خطی بر تولید آنزیم مشخص می گردد.
معادله 3-1 Y=β0+Σβi Xi در این مدل،Y پاسخ (فعالیت آنزیمی کل که به شکل واحد(U) بیان می گردد،0β ثابت مدل ،iβضریب خطی وXi سطح ابتدایی متغیر است.دراین مدل امکان بررسی اثرات متقابل فاکتور های تاثیر گذار بر پاسخ وجود ندارد و صرفأ برای غربالگری و ارزیابی فاکتورهای مهم تأثیرگذار بر پاسخ کاربرد دارد. با بررسی آنالیزرگرسیون متغیرها،فاکتورهای تأثیرگذار (معنادار) برای تولید بهینه سازی بعدی به روشRSM مورد استفاده قرار گرفتند.[46]
بر اساس برنامه ریزی انجام شده به روش Plackett-Burman به شرح زیر 12 آزمایش به منظور انتخاب بهترین منبع کربن (پودر سبوس برنج ، پودر سبوس گندم ،ساقه برنج،ساقه گندم )و منبع نیتروژن (آسپاراژین، عصاره مخمر، پپتون ، تریپتون )در بسترجامد طراحی گردید (جدول های شماره3- 5و 3-6 )

مطلب مرتبط :   منبع تحقیق درموردسلسله مراتب، اصل موضوع

جدول3- 5- سطوح کد شده بر اساس طراحی آزمایش به روش Plackett-Burman برای تخمیر در بستر جامد
شماره آزمایش سبوس برنج ساقه برنج سبوس گندم کاه گندم عصاره مخمر پپتون آسپاراژین تریپتون
1 1 1 1- 1 1- 1- 1- 1
2 1 1- 1 1- 1- 1- 1 1
3 1 1 1- 1 1 1- 1 1-
4 1- 1 1 1- 1 1- 1- 1-
5 1 1 1 1- 1 1 1- 1
6 1- 1 1 1 1- 1 1 1-
7 1- 1 1- 1- 1- 1 1 1
8 1 1- 1 1 1- 1 1- 1-
9 1- 1- 1- 1- 1- -1 1- 1-
10 1 1- 1- 1- 1 1 1 1-
11 1- 1- 1 1 1 1- 1 1