یک گرم آگاروز با 100 میلی لیتر بافر TBE مخلوط شده و به مدت 1 دقیقه و 40 ثانیه در دستگاه مایکروویو گرم شد تا به حالت نزدیک به جوشیدن برسد. سپس مقدار 5/5 میکرولیتر اتیدیوم بروماید به مخلوط اضافه گردید و کمی ظرف حاوی مخلوط حرکت داده شد تا مواد به خوبی با هم مخلوط شدند. پس از رسیدن دمای محلول به حدود 50 درجه سلسیوس و قبل از بستن ژل، محلول ژل به آرامی درون قالب ریخته شد. ضخامت ژل درون قالب می بایست حدود 5 میلی متر باشد. قبل از بستن ژل، شانه مخصوص به نحوی در داخل ژل فروبرده شد که بدون اتصال انتهای دندانه های شانه به کف قالب تنها لایه نازکی از ژل زیر این دندانه ها قرار گرفت. پس از بستن ژل، شانه به آرامی خارج و ژل به همراه قالب در محفظه دستگاه طوری قرار داده شد که دو سر آزاد ژل با مخزن بافر در تماس بود. محفظه دستگاه الکتروفورز (مدل ESP- 600Z ساخت شرکت پایا پژوهش پارس ساخت ایران) با بافر TBE به اندازه ای پر شد که بافر روی ژل را کاملاً پوشاند. مدت زمان انجام الکتروفورز، یک ساعت و با ولتاژ 120 ولت و 100 آمپر بود.
نکتۀ بسیار مهم در این مرحله استفادۀ حتمی از روپوش مخصوص آزمایشگاه، دستکش های لاتکس (در صورت امکان، چند دستکش روی هم پوشیده شود)، ماسک و عینک مخصوص می باشد، چون اتیدیوم بروماید بسیار سمی و جهش زا بوده و حتی بخارهای آن نیز نباید استنشاق گردد.
برای تهیۀ بافر TBE به روش زیر عمل شد:
5/5 گرم اسید بوریک، 37/0 گرم EDTA، 8/10 گرم Tris با 1000 میلی لیتر آب مقطر مخلوط شد و به مدت 15 دقیقه ظرف حاوی بافر حرکت داده شد تا مواد کاملاً در آب حل شوند. پس از هر بار استفاده از بافر باید درب ظرف حاوی محلول بسته شود.
3-6- روش و مشخصات دستگاه عکس برداری
ژل در داخل دستگاه Gel documentation ساخت شرکت Uvitec (انگلیس) گذاشته شد و از آن عکس برداری گردید.
3-7- روش تجزیه باندها و نرم افزار استفاده شده
پس از انجام عکسبرداری و ذخیرۀ عکس ها روی رایانه، جداول مربوط به حضور و عدم حضور باندها تهیه شد. بدینصورت که به ازای هر باند عدد یک و عدم وجود باند با عدد صفر مشخص گردید. سپس جداول مربوطه وارد برنامۀ Excel شد. در نهایت تجزیه و تحلیل داده ها با استفاده از نرم افزار NTSYS و با روش UPGMA، نسخۀ 02/2 صورت گرفت.
3-8- روش ارایه نتایج
ارایه نتایج به صورت شکل و رسم دندروگرام و ماتریس تشابه انجام شد. چون قبلاً این شناسایی ها توسط همکاران مرکز تحقیقات کشاورزی استان هرمزگان و با استفاده از نشانگرهای مورفولوژیکی صورت گرفته بود، در بررسی نتایج از مقایسۀ شکل برگ، میوه و تاج پوشش درختان مذکور نیز کمک گرفته شد و نتایج حاصل از نرم افزار NTSYS با شکل های ذکر شده در بالا مقایسه گردید.
فصل چهارم
نتایج
4- نتایج
4-1- استخراج DNA
استخراج DNA به طور موفقیت آمیزی با استفاده از روش ذکر شده در فصل سوم (دویل و دویل با کمی تغییرات) انجام شد. در خلال استخراج DNA یک بار هم استخراج به وسیلۀ کیت آمادۀ استخراج DNA ساخت شرکت Metabion (آلمان) صورت گرفت که مقدار DNA حاصل از این کیت کمتر از مقدار DNA استخراج شده به وسیلۀ روش ذکر شده در این پژوهش بود که این مقایسه با استفاده از دستگاه بایوفتومتر ساخت شرکت Eppendorf آلمان انجام شد. DNA های الگوی مورد استفاده در این پژوهش، با استفاده از روش دویل و دویل با کمی تغییرات بودند. جهت انجام آزمون DNA از روش ران کردن الگوها بر روی ژل الکتروفورز استفاده شد (نگارۀ شمارۀ4-1). همانطور که در نگارۀ ذکر شده نیز مشاهده می گردد باندهای حاصل، بسیار قوی و پر رنگ و همین مشخصۀ آن ها نشان دهندۀ کیفیت خوب DNA استخراج شده می باشد.

مطلب مرتبط :   مقاله با موضوع انعطاف پذیری و نگهداری

نگارۀ شمارۀ 4-1- نتایج حاصل از استخراج DNA به وسیلۀ ران کردن روی ژل آگاروز
2-4- آزمون آغازگرها
یک آزمون ابتدایی نشان داد که از تعداد 22 آغازگر مورد استفاده، تعداد 16 عدد از آنها بهترین و بیشترین تعداد باند را داشتند و در نتیجه جهت ادامۀ آزمایش از آغازگرهای 07-A، X-15، 05G-، 06D-، 09M-، 06M-، 09F-، 01X-، 11A-، 18X-، 12M-، 05M-، 15M-، 16A-، 15H- و20 H- استفاده شد. آغازگرهایی که به دلیل عدم باند دهی یا کم بودن تعداد ارقامی که به وسیلۀ این آغازگرها باند داده بودند، از لیست اولیه حذف شدند. آغازگرهایی که از لیست اولیه حذف شدند شامل: 11-W، 20-X، 17- X، 12- E، 11- G و 01- D می باشند. به عنوان مثال، آغازگر 20-X پس از سه بار تکرار PCR هیچ باندی با هیچ کدام از ارقام نداد. دلیل اصلی استفاده از دیگر آغازگرها، تعداد باندهای زیاد، قوی و واضح بودن باندها بوده است. از این آغازگرها نتایجی حاصل شد که یک نمونه از آن ها در زیر آورده شده است(برای مشاهدۀ کلیۀ نتایج و عکس های حاصل از آن ها به بخش ضمیمه مراجعه شود).

نگارۀ شمارۀ 4-2- آغازگر 12- M