این روش را با وجود برخی معایب، می توان به راحتی به کار گرفت. استفاده از این نشانگر برای شناسایی ارقام و رده بندی درون گونه ای و بین گونه ای در گیاهان مختلف به سرعت مورد استقبال قرار گرفت. با ابداع و معرفی روش « تجزیۀ تفرق توده » توسط میشِلمور و همکارانش در 1991، برنامه های نشانمند کردن ژن های تعیین کنندۀ صفات کیفی(مانند مقاومت به بیماری ها و آفات) به سرعت پیشرفت کرد. اِشنِل و نایت در 1992 و اِشنِل و همکاران در 1995 با استفاده از نشانگرهای RAPD، تلاش کردند که روابط فیلوژنتیکی در 25 گونۀ انبه را تخمین بزنند.10 آغازگر کوتاه، تکثیر چندشکلی تکرارپذیر را نشان دادند. جایاسانکار و همکاران در 1998 از RAPD استفاده کردند تا تحمل جهش یافته های حاصل از کشت تک رویانی انبه های Hindi و Carabao را به سمیت قارچ(Colletotrichum gloesporoides) مشخص کنند. دِنگ و همکاران در 1995، سه رقم انبه را با استفاده از RAPD مورد آزمایش قرار دادند. از میان آغازگرهای مختلف استفاده شده، مشخص شد که آغازگرهای S273، S281 و S286 ، مناسبترین آغازگرها برای تکثیر RAPD و تحلیل DNA ژنومی هستند. راویشانکار و همکاران در 2000، روابط ژنتیکی 18 گونۀ انبۀ پرورش یافته در مناطق مختلف هندوستان را با استفاده از نشانگرهای RAPD مورد تحقیق قرار دادند. کومار و همکاران در 2001، گوناگونی ژنتیکی در 50 گونۀ تجاری انبه را با استفاده از نشانگرهای RAPD ارزیابی کردند. دانهال های دورگۀ اتفاقی و انتخابی بسیار به هم پیوسته بودند در حالیکه ژنوتیپ های متفاوت از نظر ریخت شناسی و جغرافیایی، روندهای مجزایی را نشان دادند. کاریهالو و همکاران در 2003، از تحلیل RAPD برای 29 گونۀ انبۀ هندوستانی شامل گونه های landrace و پیشرفته استفاده کردند. تحلیل ناسازگاری (مغایرت) مولکولی آشکار کرد که 7/94% از گوناگونی ژنتیکی در انبه در داخل مناطق وجود داشت. بهرحال، تفاوت های میان نواحی، معنی دار بودند، نواحی شمالی و شرقی، یک حیطۀ گوناگونی و نواحی جنوبی و غربی، یک حیطۀ گوناگونی دیگر در انبه را در هندوستان تشکیل دادند. سوزا و لیما در 2004، 40 ژنوتیپ انبۀ Embrapa Meio-Norte را برای نشانگرهای RAPD با 32 آغازگر تصادفی قرار دادند. 13 تا از 32 آغازگر ابتدایی غربال شده که الگوهای تکثیر DNA چند شکلی بیشتری را نشان دادند، برای واکنش های RAPD انتخاب شدند. بر اساس نخستین نتایج آن ها، ژنوتیپ ها به دو گروه مجزا گروه بندی شدند: یکی به وسیلۀ Mallika و Amrapali تشکیل شده و دیگری شامل ژنوتیپ های دیگری می شود که خودش به دو زیر گروه تقسیم می شود که یکی به وسیلۀ Manzanilo ، Van Dyke، Palmer و Keitt شکل گرفته و دیگری شامل بقیۀ ژنوتیپ ها می شود. همچنین سریواستاوا و همکاران در 2004، کاربرد نشانگرهای مولکولی را برای تحلیل نَسَبی تعدادی از دو رگه های تجاری انبۀ هندوستان مثل (Dasheri x Neelum) Amrapali، (Neelum x Dasheri) Mallika و (Neelum x Alphonso) Ratna مورد آزمایش قرار دادند. در ابتدا سه روش SPAR، RAPD، ISSR و DAMD برای برقراری ارتباطِ parent-hybrid در مورد دو رگه های انبۀ ذکر شده در بالا که با استفاده از Neelum به عنوان یکی از والدین و والدین مربوطۀ آن ها اصلاح شده بودند، مورد استفاده قرار گرفته اند.
در مورد ژن هایی که پیوستگی سستی با نشانگرهای RFLP دارند یا اساساً پیوستگی نشان نمی دهند، نشانگرهای رپید و روش تجزیۀ تفرق توده بهترین انتخاب است. همچنین می توان برای RAPD به مزایایی از قبیل عدم نیاز به اطلاعات اولیه در مورد ردیف DNA برای طراحی و ساخت آغازگرها، امکان بررسی همزمان چندین جایگاه در ژنوم نمونه ها،عدم نیاز به کاوشگر، مواد پرتوزا و غیره، سادگی انجام کار، ارزان بودن این روش اشاره نمود.
2-4-8-ردیف های تکراری ساده یا ریز ماهواره ها (SSRs)
ردیف های تکراری ساده یا SSRs که همچنین به عنوان نشانگر های DNA ریزماهواره ای شناخته می شوند، و نسبت به بسیاری دیگر از نشانگرها مفیدتر هستند چون به طور خیلی زیادی پلی مورفیک و فراوان می باشند، توارثِ همبارز دارند و از نظر تجزیه و آنالیز، ساده بوده و به راحتی قابل انتقال می باشند. گزارش شده که ریزماهواره ها نسبت به نشانگرهای RAPD و RFLP، متغیرتر هستند و به طور گسترده ای در تحقیاقات ژنومی گیاهی مورد استفاده قرار گرفته اند(وِبِر ، 1990؛ هه و همکاران ،2003). پتانسیل اصلی مزایای ریزماهواره نسبت به دیگر انواع نشانگرهای ژنتیکی، به طور واضح تری احساس خواهد شد، زمانیکه از آنها برای پیدا کردن ویژگی های مطلوب در برنامه های بهنژادی وسیع و به عنوان نقاط تکیه گاهی برای راهبردهای کلون کردن ژن بر پایۀ نقشه، مورد استفاده قرار بگیرند(براون و همکاران ،1996). ایادتونگ و همکاران درb 1999، تعداد 22 رقم انبه را برای 40 آغازگر متصل به 18-15 الیگونوکلئوتید، آزمایش کردند. 7 آغازگر، الگوهای DNA پلی مورفیک تکرارپذیر را تولید کردند. ارقام می توانستند بر پایۀ جغرافیایی شان جدا شوند اما برتری ای بین ژنوتیپ های تک رویانی و چند رویانی، قابل اثبات نبود. نشانگرهای ریزماهواره ای برای بررسی گوناگونی ژنتیکی در انبه با استفاده از یک کتابخانۀ ژنومی غنی شده برای تکرارهای دی نوکلئوتید n(GA) و n(GT)، بسط داده شده اند. 19 لوکای SSRs با الگوهای مشخص قابل علامتگذاری، انتخاب شدند تا گوناگونی در بانک ژرم پلاسم انبۀ Guadalupe را ارزیابی کنند. تعداد آلل ها بین 13-3 متغیر بود با سطوح مشاهدۀ هتروزیگوسیتی بین 857/0- 059/0(دووال و همکاران ، 2005). در انبه، نشانگرهای ریزماهواره برای بررسی روی شناسایی، تغییرپذیری، حفاظت ژرم پلاسم، اهلی سازی و جابجایی ژرم پلاسم، بسیار مهم هستند(ویروئِل و همکاران ، 2005).
2-4-9-تفاوت طول قطعه های حاصل از تکثیر (AFLP)
فَنگ و همکاران در 1999 یک انگشت نگاری از دو رقم انبه شامل Keitt و Tommy را با استفاده از AFLP انجام دادند. ایادتونگ و همکاران در a 1999 تحلیل ارتباط ژنتیکی بین تعدادی از گونه های انبه در تایلند را با استفاده از AFLP مطالعه کردند. از نتایج آن ها، اینگونه نتیجه گیری شد که اکثر گونه ها از یک gene pool محلی انبه نمو کرده و بعداً اهلی شده اند. ایادتونگ و همکاران در b 1999 تحلیل ارتباط ژنتیکی میان بعضی از گونه های انبه را با استفاده از AFLP بررسی کردند. فَنگ وهمکاران در 2000، چند شکلی و مسیر تفرق نشانگرهای AFLP را در نتاج F1 حاصل از تلاقی رقم های انبۀ Keitt x Tommy مورد مطالعه قرار دادند. آنها میزان بالای چند شکلی را در نتاج F1 مشاهده کردند در حالیکه میانگین فراوانی تفرق، 16/37 % بود.
این تکنیک مبتنی بر PCR، اجازۀ بررسی چندشکلی را به طور مساعد در تعداد زیادی لوکای در یک فاصلۀ بسیار کوتاه زمانی می دهد و در عین حال نیازمند مقدار بسیار کمی از DNAاست. نشانگرهای AFLP برای شناسایی رقم،تخمین روابط ژنتیکی و نقشه برداری جایگاه های ژنی دخیل در صفات کمی(QTLs) در انبه، بسیار مناسبند(کَشکوش و همکاران ، 2001). جدا از شناسایی گونه های انبه و ارزیابی روابط ژنتیکی،کَشکوش و همکاران در 2001، اطلاعات AFLP را استفاده کردند تا یک نقشۀ لینکاژ ژنتیکی ایجاد کنند که عبارت از 13 گروه لینکاژی بود و 5/161 سانتی مورگان را پوشش می داد، به وسیلۀ 34 نشانگر AFLP تعیین شد. اطلاعات گسترش یافته به وسیلۀ تجزیه و تحلیل AFLP در خصوص نسبی بودن و گوناگونی موجود در gene pool انبه برای بهنژادی ارقام اصلاح شده، مفید هستند(یاماناک و همکاران ،2006). از جمله عوامل بازدارندۀ استفاده از این نشانگرها پیچیدگی نسبی این روش در مقایسه با سایر روش های مبتنی بر PCR، عدم اطلاع از جایگاه ژنی نشانگرها می باشند. غالب بودن این نشانگرها که موجب عدم امکان تشخیص افراد خالص از ناخالص می شود. توجه به این نکته ضروری است که بسیاری از تفاوت های مشاهده شده بر روی ژل هایی که تعداد زیادی باند تولید می کنند به طور ذاتی از نوع غالب یا مغلوب نیستند. بلکه بیشتر آن ها از نوع همبارز هستند، ولی چون تشخیص سیستم اللی در آنها مشکل است از نظر کاربردی ، و نتیجه نهایی و تجزبه و تحلیل، ناگزیر به تلقی آنها به عنوان نشانگرهای غالب خواهیم بود.عدم امکان تشخیص الل های هر نشانگر موجب افت کارایی این نشانگر می شود. تکثیر قطعه های غیر واقعی در AFLP نیز موجب کاهش قابلیت اعتماد این روش می گردد (نقوی و همکاران،1386).
2-4-10-نشانگرهای ISSRs
یک تکنیک نسبتاً جدید است و به عنوان یک راه نیرومند، سریع، ساده، تکرارپذیر و ارزان برای ارزیابی گوناگونی ژنتیکی و یا تشخیص ارقام بسیار نزدیک در بسیاری از گونه ها که شامل درختان میوه نیز می شوند، به اثبات رسیده است. گُنزالِز و همکاران در 2002، یک دامنۀ
توالی های آغازگر ISSR را در انبه آزمایش کردند و آنهایی را که دارای چند شکلی های واضح با ارقام پرورش یافته در استرالیا را نشان می دادند، شناسایی نمودند. آنها همچنین پتانسیل استفاده از نشانگرهای DNA برای بهبود انبه در زمینه های شناسایی رقم، ارزیابی والدین( نسبی)، تخمین گوناگونی ژنتیکی در جمعیت های موجود و توصیف پایه ها را پیشنهاد کردند.
همچنین با توجه به جدید بودن این روش، از آن بر روی گیاهان گرمسیری و نیمه گرمسیری دیگری همچون مرکبات استفاده شده است که از آن جمله می توان به تعیین ویژگی های ارقام مرکبات به کمک نشانگرهای مورفولوژیکی و مولکولی ISSR توسط شهسوار و همکاران در 1383 اشاره کرد.
2-5-نتیجه گیری
با توجه به نتایج بدست آمده در شناسایی گوناگونی ژنتیکی در انبه توسط روش های ذکر شده به نظر می رسد که رسیدن به ا هداف این بررسی یعنی اثبات وجود گوناگونی ژنتیکی، میزان گوناگونی و قرابت ژنتیکی، رفع ابهام در سیستم نامگذاری ارقام ژرم پلاسم محلی و وجود آغازگرهای مناسب، با بکارگیری روش RAPD به سادگی امکان پذیر باشد. همچنین با توجه به اینکه تا کنون بررسی های چندانی روی شناسایی و طبقه بندی ارقام انبه در ایران با استفاده از نشانگرهای مولکولی صورت نگرفته است، و با توجه به توضیحات ارائه شده در قسمت مربوط به نشانگرهای RAPD در همین فصل و نتایجی که دیگر پژوهشگران در کشورهای دیگر گرفته اند، به نظر می رسد که جهت بررسی ابتدایی میزان تشابه ژنتیکی ارقام بومی انبه در استان هرمزگان، استفاده از نشانگرهای RAPD بهتر، ساده تر، سریع تر و ارزان تر خواهد بود و راه را برای
بررسی های پسین روی گوناگونی این ارقام و دیگر ارقام بومی انبه در استان های دیگر کشور با استفاده از نشانگرهای مولکولی دیگر، هموار خواهد نمود.
فصل سوم
مواد و روش ها
3- مواد و روش ها
3-1- جمع آوری نمونه جهت استخراج DNA
نمونه های گیاهی از باغ های شهرستان میناب و همچنین از منطقۀ سیاهو از توابع استان هرمزگان جمع آوری شدند. زمان نمونه برداری در اواخر بهار بوده است. درختانی که جهت نمونه برداری مورد استفاده قرار گرفتند پیشتر در یک کار پژوهشی توسط محققان مرکز تحقیقات کشاورزی هرمزگان به عنوان ارقام بومی منطقه نامگذاری و پلاک گذاری شده بودند (رضازاده و همکاران،1375). در پژوهش پیش رو 15 رقم بومی استان هرمزگان با دو رقم وارداتی برتر (برجسته) از نظر شباهت ها و تفاوت های ژنتیکی توسط نشانگرهای مولکولی RAPD مورد مقایسه قرار گرفتند. ارقام بومی مورد بحث از نظر مورفولوژیک مورد آزمایش و مقایسه قرار گرفته و سپس کدگذاری شده بودند. نام ارقام مورد آزمایش در این پژوهش و همچنین نام انگلیسی کوتاه آنها (که از این پس در گزارش پیش رو با این نام های کوتاه از آن ها یاد می شود) شامل :
1. اربابی(Ar) – 2. حَلو(Hl) – 3. عباسی میناب(ABm) – 4. گل (Gl) –
5. خاروآزاری(Kz) – 6. شش لِنگی(Sh) – 7. مجلسی(Mj) – 8. کوزَک اسبی(Ka) –