در 10 لوله آزمایش 9 میلی لیتر آب مقطر استریل ریخته شد و از نمونه اول که از خاک تهیه شده بود 1میلی لیتربرداشته و در لوله آزمایش اول ریخته شد و سپس روی vortex قرار دادیم به همین ترتیب از لوله اول 1 میلی لیتر برداشته و در لوله دوم ریخته و این کار برای بقیه لوله ها به همین ترتیب تکرار می شود. لوله ها به صورت 1-10 تا 10-10 نام گذاری شدند.
3-2-1- مواد و محیط کشت های مورد استفاده برای جداسازی
به منظور جداسازی و کشت باکتری های مولد ال آسپارژیناز از محیط کشت M9 استفاده شد که مواد مورد استفاده در تهیه یک لیتر از این محیط به شرح زیر می باشد[47]:
جدول3- 2 – مواد مورد استفاده در تهیه یک لیتر از محیط 9 M
6 gr Na2HPO4
3 gr KH2PO4
5/0 gr NaCl
5 gr L-aspargin
2 ml MgSO4.7H2O (1M)
1 ml CaCl2.2H H2O( 0.1M)
10 ml Glucose stock 20%
20 gr Agar
3/0 ml Phenol red
روش تهیه محلول 1 مولار MgSO4.7H2O:
48/246گرم از MgSO4.7H2O را در یک لیتر آب مقطر حل کرده و محلول را آماده کردیم.
روش تهیه محلول 0.1 مولار CaCl2.7 H2O
702/14 گرم از CaCl2.7H H2O را در یک لیتر آب مقطر حل کرده و محلول را تهییه می نماییم.
محیط کشت M9 با نسبت های مذکور تهیه شد و سپس در 10 لوله آزمایش هر یک به میزان 20 میلی لیتر از محیط تهیه شده ریخته شد و لوله های آزمایش در اتوکلاو قرار داده شد. از هر یک از نمونه های تهیه شده به روش رقت های سریالی یک میلی لیتر نمونه برداشته شد و در 10 لوله حاوی محیط کشت استریل ریخته شد و به طور کامل هم زده شد و سپس در داخل پلیت ها کشت داده شد.پس از حدود 15 دقیقه محیط کشت به دلیل وجود آگار به حالت جامد درآمده و در انکوباتور در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت چهل و هشت ساعت انکوبه گردید.
کلنی های صورتی رنگ ایجاد شده در پلیت ها که نشان دهنده رشد باکتری های مولد ال آسپارژیناز می باشد با لوپ به پلیت های حاوی محیط M9 انتقال (sub culture) و به صورت خطی کشت داده شدند.این محیط، محیط کشت اختصاصی برای رشد باکتری های مولد آنزیم آسپارژیناز می باشد. کلنی های صورتی رنگ بعد از 24 ساعت انکوباسیون مشاهده شدند. به این ترتیب باکتری های مولد آنزیم را جداسازی شدند.
3-3- شناسایی گونه های مولد آنزیم
شناسایی گونه ها بر اساس بررسی لام میکروسکوپی، رنگ آمیزی گرم، روش های بیوشیمیایی در سطح جنس و شناسایی مولکولی انجام گرفت. بدین منظور آزمایشات تخمیر قندها، احیای نیترات، هیدرولیز نشاسته، تست کاتالاز انجام پذیرفت.
3-3-1- رنگ آمیزی گرم
در این رنگ آمیزی باکتری ها بر مبنای رنگ باکتری پس از رنگ آمیزی به دو دسته گرم مثبت وگرم منفی تقسیم می شوند.رنگ باکتری پس از رنگ آمیزی به توانایی حفظ رنگ اول و به عبارتی به ساختمان دیواره سلولی باکتری بستگی دارد.در این رنگ آمیزی باکتری های گرم مثبت پس از رنگ آمیزی به رنگ بنفش و باکتری های گرم منفی به رنگ قرمز مشاهده می شوند.
3-3-2- شناسایی مولکولی
3-3-2-1- مراحل کلی شناسایی مولکولی:
1. استخراج DNA ژنومی و الکتروفورز