استفاده از دستگاه بایوفوتومتر ساخت شرکت Eppendorf محصول کشور آلمان.
ران کردن مستقیم در ژل آگاروز 1% ( نگارۀ شمارۀ4-1).
3-4- انجام PCR
3-4-1- مواد لازم
جهت انجام PCR به مواد زیر نیاز است: بافر PCR، dNTPs، آنزیم DNA پلی مراز.
برای انجام PCR بافرهای مختلفی وجود دارند؛ متداول ترین بافر که با آنزیم DNAپلی مراز Taq مورد استفاده قرار می گیرد دارای اجزای زیر است، نکتۀ شایان توجه این است که غلظت این بافر x 10 می باشد :
(در درجه حرارت اتاق) 3/8 = pH و HCl – mMTris 100
KCl mM 500
کلرور منیزیوم mM 15
ژلاتین (W/V) 1/0 %
ترکیب بافر برای استفاده با سایر آنزیم های DNA پلی مراز مقاوم به حرارت ممکن است متفاوت باشد، اما به هر حال بیشتر پژوهشگران و یا شرکت های سازنده به طورمعمول برای استفاده از هر آنزیم، بافر x10 مربوط به آن را تهیه می کنند. غلظت کلرور منیزیوم در مخلوط نهایی واکنش متفاوت و بین mM 5 – 5/0 می تواند متغیر باشد، تا بهترین غلظت کلرور منیزیوم را در واکنش بتوان تعیین نمود.
یون های Mg2+ با dNTPs یک کمپلکس محلول تشکیل می دهند، که تشکیل این کمپلکس برای ورود dNTPs به داخل زنجیرۀ در حال سنتز ضروری است. همچنین این یون ها فعالیت پلی مرازی آنزیم DNA پلی مراز را تحریک می نمایند و گذشته از آن، باعث افزایش Tm مربوط به مولکول های DNA دورشته ای و اثر متقابل مربوط به کمپلکسDNA الگو و آغازگر
می شوند. غلظت کلرور منیزیوم می تواند تأثیر قابل توجهی بر روی بازدهی و اختصاصی بودن واکنش PCR داشته باشد. به طورمعمول غلظت مناسب کلرور منیزیوم بین mM 5/1 – 1 است، اما گاهی اوقات ممکن است که مقادیر متفاوتی یون Mg2+ لازم باشد. به طور کلی مقادیر کم Mg2+ منجر به کاهش بازدهی PCR و مقادیر بالای Mg2+ باعث افزایش فرآورده های کاذب و غیر اختصاصی خواهد شد.
بافرهای مورد استفاده در این پژوهش، محصول شرکت سیناژن ساخت ایران بودند. همچنین کلرور منیزیم استفاده شده و آنزیم DNA پلی مراز مورد استفاده نیز محصول همان شرکت و ساخت کشور ایران بودند. dNTPs استفاده شده در این پژوهش ساخت شرکت BioFlux بوده است.
در حقیقت به جز موادی که توسط کارخانجات سازندۀ آن انحصاراً برای PCR تولید و ضمانت می شوند، مابقی مواد ممکن است با DNA بیگانه آلوده باشند. آلودگی های متفرقه را نمی توان به آسانی کنترل نمود، اما به هر حال بسیار بعید است که این قبیل آلودگی ها در تکرار آزمایش باز هم مشاهده شوند. بسیار مهم است که به همراه PCR به ویژه در مواردی که قصد از انجام آن، کارهای تشخیصی و کلینیکی است، آزمایشات کنترل نیز انجام شود. کنترل منفی باید به منظور تعیین آلودگی واکنش با DNA بیگانه (به عنوان مثال DNA ژنومی، DNA مربوط به عوامل آلوده کننده و یا فرآورده های مربوط به PCR قبلی) در هر آزمایش در نظر گرفته شود.
برای اجتناب از آلودگی در PCR روش های مختلفی وجود دارد که برخی از آن ها متداول می باشند، اما بعضی دیگر روش هایی اختصاصی به حساب می آیند که برای به حداقل رسانیدن مشکلات مربوط به آلودگی می توان از آن ها سود جست.
رعایت نکات ناچیزی در ارتباط با میکرو پیپت ها، از قبیل مستقیم و عمودی قرار دادن و اتصال یک سر پیپت به انتهای آن ها به منظور جلوگیری از ورود گرد و غبار هوا به داخل دستگاه، در حالتی که از آن ها استفاده ای نمی شود، از جملۀ این موارد می باشند.
3-4-4- اختصاصی بودن واکنش PCR
شرایط مختلفی می تواند سبب افزایش اختصاصی بودن تکثیر PCR گردد :
استفاده از کمترین مقدار مورد نیاز از dNTPs ، Mg2+ ، آغازگر و آنزیم DNA پلی مراز Taq .
استفاده از کمترین تعداد چرخه و کوتاه بودن مدت زمان هر چرخه .