8-   ضخامت لایه آگار داخل پلیت ها نباید از 4-3 میلی متر تجاوز کند .
9-   پس از آماده و منجمد شدن محیط های ساخته شده، پلیت ها را به مدت 24 ساعت در حرارت 37 درجه  انکوبه کنید . رشد باکتری بر روی این محیطهای کنترل ، نمایانگر آلوده بودن محیط ها است . بنابراین از این محیطهای آلوده نباید استفاده کرد . محیط بلاد آگار در داخل یخچال به مدت یک هفته پایدار است و چنانچه بنحوی از تبخیر آب آن جلوگیری شود، پایداری آن بیشتر می‌شود.
نمونه برداری
برای انجام تحقیق به جوجه کشی شرکت کشت و صنعت مهاباد مراجعه شد و از تخم مرغ های هچ نشده طی 4 مرحله در چهار فصل پاییز ، زمستان ، بهار و تابستان هر بار 50 نمونه ، در شرایط استریل بوسیله سواپ استریل پس از ضدعفونی کردن تخم مرغ بوسیله الکل ، قسمت کلاهک را بوسیله قیچی استریل برش داده و از قسمت داخل تخم مرغ نمونه برداری بعمل آمده و سریعا در داخل محیط کشت انتقالی (پپتون واتر ) کشت داده شد.
2-5 مرحله ارجاع نمونه ها به آزمایشگاه:
پس از نمونه برداری؛ نمونه ها در کنار یخ به آزمایشگاه میکروبیولوژی دانشگاه آزاد اسلامی واحد ارومیه انتقال داده شد و به مدت 24-48 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد قرار گرفتند. بعد از این مرحله دو محیط بلاد آگار و مکانکی آگار طبق دستور کارخانه سازنده آنها آماده شده و سپس باکتریهای مورد نظر کشت داده شدند. کشت باکتریها در مجاورت شعله و تحت شرایط استریل انجام میگرفت. بعد از کشت دادن باکتریها در این دو محیط ، پلیت ها را به انکوباتور 37 درجه سانتی گراد منتقل کرده تا 24-48 ساعت در آنجا مانده و پرگنه ها ظاهر شوند. بعد از رشد باکتریها و تشکیل پرگنه ها بررسی های لازم صورت گرفته که این بررسیها ابتدا بر اساس نوع، شکل، اندازه ، رنگ ، بوی پرگنه . پس از آن رنگ آمیزی گرم و تهیه لام برای بررسی میکروسکوپی می باشد. بنابراین لازم است دوباره از آنها کشت جداگانه به عمل آید تا خالص سازی شوند. پس از رنگ آمیزی گرم و تهیه لام یک قطره روغن صدر روی لام ریخته و در زیر میکروسکوپ نوری با بزرگ نمایی 100 X مورد مطالعه قرار می گیرد.در این رنگ آمیزی ، باکتریهای گرم مثبت (بنفش رنگ) و گرم منفی (صورتی رنگ ) و کوکسی یا باسیلی بودن آنها مورد ارزیابی قرار می گیرد.
به طور کلی تشخیص اولیه بر پایه شکل پرگنه و لام میکروسکوپی تهیه شده و پس از آن تشخیص قطعی به وسیله محیط افتراقی و جداول استاندارد صورت می پذیرد. (Quinn,etal.1994)
2-5-1 تشخیص کوکسی های گرم مثبت
از کشت خالص ، لام تهیه کرده و رنگ آمیزی گرم انجام داده و نوع باکتریها به لحاظ گرم مثبت یا منفی بودن تعیین می گردند. در مورد باکتریهای گرم مثبت که کلونی آنها در محیط بلاد آگار رشد کرده بود ، آزمایشات کاتالاز و کوآگولاز انجام میدهیم. استافیلوکوک چون گرم مثبت و کوکسی شکل میباشد برای تفریق آن از استرپتوکوکوس تست کاتالاز انجام میگیرد که برای این کار یک قطره آب اکسیژنه را روی لام ریخته و سپس توسط آنس استریل ، کلونی باکتری را از محیط برداشته و به آن اضافه میکنیم. اگر آب اکسیژنه حباب دار گردد نشانه مثیت بودن تست می باشد. این تست در مورد استافیلوکوک ها مثبت و در مورد استرپتوکوک ها منفی می باشد. سپس تست کوآگولاز انجام داده و برای این کار مقدار 5/0 سی سی پلاسمای سیتراته را در لوله همولیز ریخته و با هم مخلوط و آن را بمدت 4 ساعت در انکوباسیون 37 درجه سانتی گراد قرار می دهیم. اگر لخته ایجاد شد باکتری کوآگولاز مثبت و در غیر این صورت کوآگولاز منفی می باشد.
2-5-2 تشخیص باسیل های گرم مثبت
باسیلوس سرئوس باسیل گرم مثبتی است که در محیط بلاد آگار پرگنه های یال شیری تشکلیل می دهد و همولیز ضعیفی در اطراف کلنی ایجاد میکند که دارای رنگ متمایل به سبز می باشد و در زیر میکروسکوپ باسیل های منحصر به فردی تشکیل می دهد.
2-5-3تشخیص باکتریهای گرم منفی
ابتدا باکتری از نظر پرگنه بررسی گردید. باکتری اشرشیاکلی لاکتوز موجود در محیط را به شدت تخمیر نموده و پرگنه های منحصر به فردی را روی این محیط ایجاد می کند که دارای جلای فلزی می باشد. کلبسیلا تخمیر کننده ضعیف لاکتوز می باشد و کلنی های ارغوانی رنگی را بر روی محیط متیلن بلو تولید می کند . پروتئوس هم که قادر به تخمیر لاکتوز نیست بر روی این محیط کلنی های شفاف ایجاد می کند. برای بررسی دقیق تر باکتریهای گرم منفی از محیط های افتراقی استفاده می شود که ذیلا به شرح آنها می پردازیم
2-6تشخیص تفریقی :
2-6-1 محیط (SH2, Indole , Motility) SIM :
از این محیط برای تشخیص تفریقی گونه های انتروباکتریاسه حاوی ترکیبات سولفیدی استفاده میشود. این محیط حرکت باکتری ، تولید گاز و تولید اندول را به ما نشان می دهد. کدر بودن و تشکیل سرو وارونه در محیط نشان دهنده متحرک بودن باکتری است. در مورد اندول از معرف کواکس استفاده می گردد که اگر محیط قرمز شود نشاندهنده تجزیه تریپتوفان توسط باکتری و تولید اندول می باشدو اگر محیط زرد باقی بماند ، اندول منفی می باشد.
محیط سیترات :
کاربرد این محیط به استفاده باکتری از کربن می باشد. اگر باکتری از کربن استفاده نکند ، محیط سبز باقی خواهد ماند و سیترات منفی می باشد. در صورت استفاده ،باکتری سیترات آمونیوم را به کربنات آمونیوم تبدیل کرده و محیط آبی رنگ میگردد و تست سیترات مثبت خواهد بود.
2-6-3محیطTSI :
این محیط دارای قند های گلوکوز ، لاکتوز و ساکارز و همچنین آهن میباشد که آهن موجود به منظور نشان دادن تولیدگاز SH2 است. این محیط دو واکنش تخمیر قندها و تولید گاز را به ما نشان می دهد که تخمیر قندها به قابلیت تولید آنزیم بستگی دارد.
2-6- 4محیط اوره :