یکی از مهم‌ترین عوامل ایجاد رشد و اندامزایی در کشت بافت گیاهی، مواد تشکیل دهنده محیط کشت میباشد محیطکشت بافت گیاهی به طور کلی از بخشی یا تمام مواد زیر تشکیل شده است.
عناصر پرمصرف، عناصر کممصرف، ویتامینها، اسیدهایآمینه و دیگر مواد نیتروژندار، قندها، موادکندکننده رشد، مواد جامدکننده یا سیستم حمایتکننده مانند آگار، افزودنی‌های آلی نامشخص نظیر ذغال فعال وآب. به طور معمول چندین دستور تهیه برای بیشتر کارهای کشت بافت و سلول مورد استفاده قرار میگیرد. این دستورها در برگیرنده آنچه توسط وایت، موراشیک و اسکوگ (MS) ، گمبورگ و همکاران (B5)، شنگ ، هیلدر برانت (SH) نیچ و لویدومک کاون پیشنهاد شده میباشند. محیط کشتهای MS ، SH و B5 همگی دارای مقادیر زیادی از عناصر پرمصرف میباشند. در حالی که در سایر محیطهای کشت عناصر پرمصرف به میزان قابل توجهی کمتر است.
1-2-1- عناصر پرمصرف و کممصرف
عناصر پرمصرف در برگیرنده شش عنصر اصلی نیتروژن، فسفر، پتانسیم، کلسیم، منیزیم و گوگرد میباشد که برای کشت بافت و سلول گیاهی مورد نیاز است. غلظت بهینه هر ماده غذایی برای دستیابی به میزان رشد حداکثر، به میزان زیادی بین گونههای گیاهی متفاوت است. پتاسیم برای رشد سلول بیشتر گونههای گیاهی مورد نیاز میباشد. بیشتر محیط کشتها، دارای پتاسیم به صورت نیترات و کلراید به غلظت 20 تا 30 میلیگرم میباشند. غلظت بهینه فسفر، منیزیم، گوگرد و کلسیم از 1 تا 3 میلیگرم در لیتر میباشد مشروط بر اینکه سایر نیازهای رشد سلولی تامین شده باشند. در صورتی که کمبود سایر مواد غذایی وجود داشته باشد، غلظتهای بالاتری از مواد اشاره شده لازم است (تورز، 1377).
عناصر کممصرف اصلی برای کشتبافت و سلولهای گیاهی در برگیرنده آهن، منگنز، روی، بر، مس و مولیبدن میباشند. در حالت عادی، برای تهیه محیط کشت، شکلهای کلات آهن و روی مورد استفاده قرار میگیرد. آهن ممکن است مهم‌ترین عنصر کممصرف باشد. سیترات و تارتارات آهن نیز ممکن است در محیط کشت به کار روند، اما این ترکیب به سختی در آب حل میشوند و معمولاً پس از تهیه کشت رسوب میکنند. امکان افزودن کبالت و ید به برخی از محیطهای کشت وجود دارد اما نیاز مبرم به این عناصر برای رشد سلول گیاهی ثابت نشده است. سدیم و کلر نیز در برخی از محیط کشتها به کار میروند، اما نیاز اساسی به آن‌ها برای رشدیاختهها وجود ندارد. مس و کبالت در حالت عادی به غلظت 1/0 میکرومول به محیط کشت افزوده میشود (برگ و والنتین، 1976، بیک و استرابر، 1978، بیک و همکاران، 1960 ).
1-2-3- کربوهیدرات‌ها
کربوهیدرات‌ها جزء بسیار مهمی در هر نوع محیط کشت است، چون معمولاً شرایط رشد برای فتوسنتز کافی نیست. یا اصولاً به علت تاریکی، فتوسنتز انجام نمیشود. اضافهکردن هیدراتهایکربن، در واقع قندها به محیطکشت ضروری است. از میان کربوهیدرات‌ها ساکاروز ترجیح داده میشود. گلوکز و فروکتوز در برخی از موارد میتواند جایگزین شود. گلوکز به اندازه سوکروز موثر است و فروکتوز تا حدودی اثر کمتری دارد. غلظت ساکاروز در محیط کشت در حالت عادی بین 2 تا 4 درصد است. کربوهیدرات‌ها پس از ساخته شدن محیط کشت و قبل از اندازه گرفتن اسیدیته به محیط کشت افزوده میشوند (آزادی و معینی،1380، تورز،1377 و هارتمن و همکاران، 1378).
1-2-4 -ویتامینها
ویتامینهایی که بیشتر در محیط کشت بافت و سلول به کار میروند عبارت‌اند از : تیامین، اسیدنیکوتینیک، پیریدوکسین، میواینوزیتول و در برخی محیط کشتها اسید اسکوربیک.
استفاده از تیامین تقریباً الزامی است و اسید نیکوتینیک و پیریدوکسین به دلیل نیاز برخی از بافتهای گیاهی به طور معمول به محیط کشت افزوده میشوند. استفاده از اسید اسکوربیک به معنای نیاز گیاه نبوده و به عنوان آنتیاکسیدانت به کار میرود.
میواینوزیتول یکی از اجزای فعال شیره نارگیل میباشد و به طور معمول در بسیاری از محلولهای ویتامیندار استفاده میشود. وجود میواینوزیتول در محیط کشت الزامی نیست اما در مقادیر کم رشد سلولی را در بیشتر گونهها تحریک میکند (پیریک، 1376 ، تورز،1377 ، واعظ لیواری،1381 و هارتمن و همکاران، 1378).
1-2-5- اسیدهای آمینه و سایر افزودنیهای نیتروژن دار
با آنکه یاختههای کشت شده به طور عادی قادر به سنتز تمام اسیدهای آمینه مورد نیاز خود هستند، افزودن برخی از اسیدهای آمینه یا آمیزهای از اسیدهای آمینه ممکن است موجب رشد بیشتر سلولها شود. کاربرد اسیدهای آمینه به ویژه برای کشتهای سلولی و پرتوپلاست اهمیت دارد. گلوتامین متداول‌ترین منبع ازت است اگرچه از آدنین و آسپارژین نیز میتوان استفاده کرد (پیریک، 1376 ، تورز،1377).
1-2-6- مواد جامدکننده یا سیستم حمایتکننده
آگار یکی از مشتقات نوعی علف هرز دریایی است و میتواند به صورت مادهای مولد ژل در اکثر محیطهای کشت به کار رود. هنگام آمیختهشدن آگار با آب ژلی تولید میشود که در دمای حدود 60 تا 100 درجه سانتیگراد ذوب شده و در دمای 45 درجه سانتیگراد جامد میگردد. از این رو ژل آگار با تمام دماهای نگهداری، سازگاری دارد. افزون بر این، آگار واکنشی با مواد تشکیلدهنده ومحیط کشت نداشته و توسط آنزیمهای گیاهی جذب نمیشود. سفتی ژل آگار بستگی به غلظت و نوع آگاری که در محیط کشت به کار رفته و نیز pHمحیط کشت دارد.
غلظتهایی از آگار که به طور معمول در محیطهای کشت یاخته گیاهی به کار میرود بین 6/0 تا 8/0 درصد است. اگر غلظت کمتر (4/0 %) بکار رود محیط کشت خصوصاً زمانی که pH پائین است خوب سفت نمیشود و اگر غلظت بالاتر انتخاب شود محیط کشت خیلی سفت شده و قرار دادن ریزنمونه را مشکل میسازد (واعظ لیواری،1381).
1-2-7- تنظیم کنندههای رشد
تنظیمکنندههای رشد گیاهی تمام مراحل رشد و نمو گیاهان را تحت تاثیر قرار میدهد. استفادهی بهینه از این تنظیمکنندهها، باعث ارتقای سطح کمی و کیفی گیاهان از جمله گیاهان زینتی میشود. این تنظیمکنندههای رشد گیاهی بهصورت تجاری، برای بهبود کیفیت تولید برخی از گیاهان ارزشمند زینتی از قبیل گلهای شاخهبریده، گیاهان برگ زینتی، گیاهان گلدانی و غیره مورد استفاده قرار میگیرند (شکاری و همکاران، 1384).
چهار گروه تنظیم کننده رشد در کشت بافت گیاهی از اهمیت برخوردار است : اکسینها، سایتوکنینها، جیبرلینها (GA3) و اسید آبسیزیک (ABA). اسکوک و میلر اولین کسانی بودند که گزارش کردند نسبت اکسین به سایتوکنین، نوع و میزان اندامزایی را در کشتهای سلول گیاهی تعیین میکند (مدفورد و همکاران، 1989). معمولاً یک اکسین و یک سایتوکنین به محیطهای کشت افزوده میشود تا ریختزایی صورت گیرد. گرچه نسبت هورمونهای لازم برای انگیزش ریشه و شاخساره همیشه یکسان نیست. گوناگونی قابل توجهی بین جنسها، گونهها و حتی رقمها از نظر نوع و میزان اکسین و سایتوکنین مورد نیازشان برای انگیزش ریختزایی موجود است. جیبرلینها و اسید آبسایزیک گهگاه در محیطهای کشت به کار میروند. به طور کلی جیبرلینها باعث رشد طولی میان گرهها و رشد مریستم یا جوانهها میشوند و افزودن اسید آبسایزیک به محیط کشت برای ممانعت از رشد پینه بر حسب گونه گیاهی یا ترغیب آن و جلوگیری از مراحل آخر نمو رویان است (پیریک، 1376 ، تورز،1377).
1-2-7-1- سایتوکنینها
سایتوکنینها ترکیبات جایگزین آدنین هستند که تقسیم سلولی و سایر فعالیتهای تنظیمکنندگی را شبیه کینتین (Kin) تحریک میکنند. این مواد تقریباً در همه گیاهان عالی، خزهها، قارچهای بیماری زا و غیربیماریزا و نیز در tRAN میکروارگانیسمها وسلولهای حیوانی یافت میشوند.
سایتوکنینها در نواحی مریستمی و نواحی دارای پتانسیل رشد زیاد مانند ریشهها، برگهای جوان، میوههای کامل و بذور به مقدار زیاد وجود دارند. به احتمال قوی سایتوکنینهادر ریشهها سنتز شده و به ساقه فرستاده میشوند، زیرا گزارشهای زیادی مبنی بر اینکه سایتوکنینها در شیره آوندهای چوبی وجود دارند، منتشر شده است با این حال وفور سایتوکنین در میوه و بذر نیز احتمال سنتز سایتوکنین در این اندامها را تقویت میکند (آرتکا، 1379).
امروزه بیش از 200 نوع سایتوکنین طبیعی و مصنوعی شناخته شده است (ماتسوبارا، 1990)، معروف‌ترین آن‌ها عبارت‌اند از Kin،BA، BPA، ZIP،TDZ (آرتکا، 1379).
فهرست واکنشهای بیولوژیکی که توسط سایتوکنینها فعال میشوند به قرار زیراست :
تقسیم سلولی، اندامزایی، بزرگ شدن سلولها و اندامها و جوانهزنی بذور، نمو جوانه و ساقه، جلوگیری از تخریب کلروفیل، تکامل کلروپلاست، به تعویق انداختن پیری، باز و بسته شدن روزنهها، تکامل جوانهها و شاخهها، انتقال انتخابی مواد غذایی و مواد آلی به بافتهای تیمار شده (آرتکا، 1379، مدفورد و همکاران، 1989 ، ون استادن و همکاران، 1998).