3-3-3- آمادهسازی هود (لامینار ایرفلو)
برای شروع آزمایش و نیم ساعت قبل از شروع عملیات، درحالی که تمام ظروف و نمونههای گیاهی به زیر هود منتقل شدند، لامپ ماوراء بنفش موجود در هود روشن گردید. قبل از شروع کار، محیط زیر هود با الکل ضدعفونی گردید. به این صورت تمامی سطوح ضدعفونی شدند. در حین انجام کشت، برای ضدعفونی ابزار مورد استفاده زیر هود، پس از فرو بردن در اتانول 96 درصد از طریق چراغ الکلی شعله داده شدند.
شکل3-2- آماده سازی هود لامینارفلو برای کشت
3-3-4- آمادهسازی محیط کشت کورم ارکیده
برای کشت کورم ارکیده، از محیط کشت مایع و جامد MS و هورمون استفاده گردید. بدین صورت که محیط کشت طبق دستور تهیه ساخته، در حالیکه هورمون به آن اضافه شده بود، تهیه گردید. آنگاه محیط کشت آماده شده داخل شیشه‌های مربا به مقدار 40 میلیلیتر، توزین و پس از استریل کردن با اتوکلاو در دمای 121 درجه سانتیگراد و فشار 1/1 اتمسفر به مدت 20 دقیقه به زیر هود انتقال داده شدند.
شکل3-3- تهیه محیط کشت برای ارکید
3-3-5- آمادهسازی کورم ارکیده
برای کشت کورم ارکیده، ابتدا دستهای خود را از آرنج تا نوک انگشتان با صابون یا مایع دستشویی به خوبی شسته و پس از خشک کردن دست‌ها، با دستکش استریل کار را شروع می‌کنیم. لازم به ذکر است که برای کار در زیر هود از قبل باید دو شیشه مربا را پس از ضد عفونی در زیر هود قرار دهیم و آن‌ها را تا نزدیک به نیمه از الکل 96 درصد پر کنیم برای اینکه پس از پایان برش نمونه‌های داخل هر شیشه لازم است تا وسایل برش مجددا با مواد و شعله ضدعفونی شده و جهت خنک شدن و نیز ضد عفونی مجدد در داخل شیشه‌های الکل قرار گیرند.
پس از ضدعفونی کردن پنس و تیغ با الکل و حرارت مستقیم چراغ الکلی با احتیاط کامل در شیشه حامل کورمها را باز کرده و با پنس کورمها را از داخل شیشه بیرون آورده و در داخل پتریدیش قرار میدهیم آنگاه با یک پنس مجموعه کورمها را نگه داشته و با تیغ کورمها را جدا میکنیم. پس از جداسازی کورمها در داخل پتریدیش، کورمهای جدا شده را با پنس درون شیشه‌های مربا که حاوی محیط MS وهورمونها میباشند با احتیاط و دقت فراوان قرار میدهیم. نکته حائز اهمیت این است که در هر شیشه مربا (محیط MS) باید 4 کورم گذاشته شود. پس از قرارگیری کورمها در داخل محیط MS ابتدا در شیشه‌ها را بسته وسپس با نوار پارافین دور شیشهها را برای جلوگیری از ورود قارچ و میکروب میبندیم. شیشهها پس از کشت شدن به اتاق کشت یا فیتوترون انتقال داده شدند و در آنجا بر روی قفسههای مخصوص و در زیر نورهای مصنوعی قرار گرفتند.
3-4- چگونگی اندازهگیری صفت‌ها
پس از حدود 50 تا 60 روز از قرارگیری کورمها در داخل محیط کشت و رسیدن به حد مطلوب، اقدام به اندازهگیری صفات مختلف گردید. در این اندازهگیری ابتدا وسایل اندازهگیری را که شامل 2 تا 3 عدد پنس،2 عدد دسته تیغ و تعداد 6 عدد پتریدیش را پس از شستشو وخشک کردن، ابتدا پنسها و دسته تیغ‌ها را از طریق ورق فویلآلومینیومی پوشانده و نیز پتریدیشها را به تعداد هر2 عدد در یک کیسه فریزر قرار میدهیم. سپس کل وسایل را در داخل اتوکلاو گذاشته و به مدت 20 دقیقه و با حرارت بخار 121 درجه سانتی گراد و با فشار 1/1 اتمسفر حرارت دادیم. پس از پایان عملیات ضد عفونی وسایل و جهت شروع عملیات اندازهگیری صفات، دستگاه هود لامینارایرفلو را روشن و پس از دقایقی با الکل 75/0 داخل هود را تمیز و ضدعفونی کردیم. آنگاه وسایل ضدعفونی شده را به زیر هود انتقال دادیم و نیز شیشههای حاوی کورمهای رشد یافته را از اطاق فیتوترون به زیرهود منتقل نمودیم. در ادامه انجام کار جهت اندازه گیری صفات پس از انتقال شیشه‌ها به زیر هود با بستن ماسک بر روی صورت و نیز پوشاندن دست‌ها با دستکش از طریق اسپری حاوی الکل 75/0 ابتدا دست‌های خود را از قسمت آرنج تا قسمت‌های پوشانده شده با دستکش الکلپاشی نموده وسپس دور شیشه‌های منتقل شده به زیر هود را جهت کاهش واز بین بردن عوامل بیماری زا و قارچی به خوبی با الکل اسپری می‌کنیم. سپس پنس و تیغ اسکالپل را جهت برش و جداسازی به صورت مجزا بر روی شعله چراغ الکلی قرار دادیم پس از شعله دادن و اطمینان از ضدعفونی مجدد لوازم اندازهگیری آن‌ها را در داخل شیشههای حاوی الکل 75/0 درصد که از قبل شیشه‌های آن‌ها را در داخل اتوکلاو ضد عفونی کردیم و داخل آن‌ها را تا نیمه از الکل سفید 75/0 پر کردیم قرار می‌دهیم، این عمل هم به جهت ضدعفونی مجدد می‌باشد وهم به خاطر سرد کردن پنس و تیغی که بر روی شعله قرار داده بودیم. یادآور میشود که برای اندازه گیری نمونه‌ها از کاغذ شطرنجی استفاده گردید که ابتدا آن را با الکل 75/0 درصد ضدعفونی کردیم و سپس آن را در زیر شیشه‌های پتریدیش قرار دادیم، کورمهای رشد یافته را بعد از بیرون آوردن از شیشههای محیط کشت از طریق پنسها در داخل پتریدیشهایی که بر روی کاغذهای شطرنجی میلیمتری قرار داشتند گذاشته واندازهگیری انجام شد. در این اندازهگیری اندازه ریشه‌ها و طول گیاه را با کاغذ میلیمتری اندازهگیری کردیم وتعداد برگ‌ها، تعداد ریشه‌ها و مجموع کورمها را شمارشکردیم و نتایج یادداشت‌ها در جدولی نوشته و ثبت شد.
3-5- شرایط گلخانه ای
پس از خارج کردن گیاهچهها از شیشه و انتقال آنها به محیط کشت پرلیت، گیاهچهها را به گلخانه سازگاری انتقال داده لازم به ذکر است که در گلخانه رطوبتی معادل 85 تا 90 درصد و دمای 20 تا 24 درجه سانتیگراد و نوری معادل 2000 لوکس به گیاه داده شد. آبیاری هر4 روز یک بار به روش دستی انجام گرفت.
3-6- تجزیه و تحلیل دادهها
تجزیه و تحلیل دادهها با استفاده از نرمافزارهای آماری SPSS و MSTATC انجام شد. جهت تجزیه واریانس دادهها برای مقایسه میانگینها از آزمون LSD در سطح احتمال 5 درصد استفاده شد. در ادامه با استفاده از نرمافزار Excel نسبت به رسم نمودار اقدام شد.
فصل چهارم
نتایج و بحث
ارزیابی صفات در محیط کشت درون شیشه ای
طول گیاه
نتایج حاصل ازتجزیه واریانس تیمارها در مورد تاثیر سطوح مختلف نانو ذرات آهن بر طول گیاه Orchis catasetum نشان داد که تاثیر نانو ذرات آهن در سطح 1% آماری معنیدار بوده است. مقایسه میانگین تیمارها نشان داد که استفاده از نانو ذرات آهن (NA1) با دز 0.034میلیگرم در لیتر با 74/72 میلیمتر تیمار برتر بوده و با شاهد که استفاده از عنصر آهن در بستر درون شیشهاییMS بوده است و در یک گروه آماری قرار گرفته‌اند، همچنین استفاده از 0.069 میلیگرم در لیتر نانو ذرات آهن ( ( NA2 در محیط کشت MS و همچنین استفاده از 0.139 میلیگرم در لیتر نانو ذرات آهن (NA3) در محیط کشت MS با هم در یک گروه آماری قرار گرفته‌اند همچنین استفاده از 0.069 میلیگرم در لیتر نانو ذرات آهن در محیط کشت MS کمترین تاثیر را داشته است.
مطالعهی کمالی جامکانی و همکاران (1390) بر روی اثر نانو کود کلات آهن در مرزه (Satureja hortensis) نشان داد که تغییرات مورفولوژیکی بارزی بین گیاهان تیمارشده و شاهد مشاهده نشد. اندازهگیری طول اندام هوایی و ریشه، افزایش معنیداری را در ارتفاع اندامهوایی در تیمار شاهد نسبت به تیمار نانوی آهن نشان داد.
در مطالعهی رجببیگی و همکاران (1386) بر روی ریحان (Ocimum basilicum) نیز تغییرات مورفولوژیکی بارزی مشاهده نشد، اما اندازهگیری طول ساقه نشان داد که در تمامی گروههای تیمارشده، رشد گیاهان نسبت به گروه شاهد، 5/1 درصد کاهش یافت. لبافی و همکاران (1390) بر روی گوجهفرنگی و بقایی و همکاران (1390) بر روی زعفران نشان دادند که نانو کلات آهن، صفات کمی و کیفی را در این دو گیاه تغییر داد. این یافتهها با یافتههای تحقیق حاضر منطبق است. مطالعهی بزرگی (2012) بر روی اثر نانوکود کلات آهن بهصورت اسپری در بادنجان (L. Solanum melongena) نشان داد که این کود بهصورت معنیداری تمام صفات را تغییر داد. این محقق نشان داد که بالاترین ارتفاع گیاه (3/112 سانتیمتر) و تعداد شاخه در گیاه (05/3) با کاربرد 2 گرم در لیتر نانوکلات آهن بهصورت اسپری بهدست آمد. کوتاهترین ارتفاع (21/87 سانتیمتر) و کمترین تعداد شاخه (65/2) در تیمار شاهد (بدون اسپری برگی کود نانوکلات آهن) مشاهده شد. نتایج مطالعهی ما در ارتباط با بیش‌ترین تعداد شاخه در گیاه کاملا با نتایج مطالعهی این محقق هماهنگی دارد، بهطوریکه بیش‌ترین تعداد شاخه در گیاهان تیمارشده با غلظت 8/1 گرم در لیتر نانوکلات آهن مشاهده شد. اگرچه کمترین تعداد شاخه در گیاهان تیمارشده با بیش‌ترین غلظت نانوکلات آهن (5/4 گرم در لیتر) مشاهده شد. نتایج مشابهی در گیاهان مختلف بهدست آمد (عباس و همکاران، 2009؛ شیخبگلو و همکاران، 2010).
جدول4-1- جدول مقایسه میانگین اثر تیمار نانو کود بر طول گیاه
1 2 3 Total
————————————————-