PCR-RFLP تکنیکی است که به تفاوت میان محل های اثر آنزیم محدود کننده در نمونه های DNA که توسط آنزیم های محدود کننده قطعه قطعه شده اند و بر حسب طولشان با ژل الکتروفورز تفکیک می شوند استناد میکند. آندونوکلئازهای محدودکننده، آنزیمهای ویژهای هستند که می توانند توالی های نوکلئوتیدی ویژه ای را برش دهند به دلیل این توانایی برای انها تشخیص تغییرات نوکلئوتیدی در DNA ممکن است. گاهی اوقات انها می توانند بیشتر بر روی یک loci تاثیر بگذارند تا یک هدف، اما بخش مهم این پروسه این است که امکان شناسایی چند شکلی یا جهش loci خواه محل شکاف دست نخورده باشد یا نباشد فراهم می شود]11[.
PCR-RFLP روشی آشنا برای ژنوتایینگ است یک جستجو در PubMed در 30 اکتبر 2011 با واژه جستجوی pcr و rflp 15725 نتیجه را نشان داد. اولین گام در آنالیز PCR-RFLP تکثیر قطعه ای است که شامل تنوع می شود که این کار با تیمار قطعه تکثیر شده با یک آنزیم محدود کننده مناسب انجام می گیرد. از آنجایی که حضور یا عدم حضور آنزیم محدود کننده در محل های تشخیصی منتج به شکل گیری قطعات محدود شونده با اندازه های مختلف می شود با الکتروفورز قطعات می توان آلل ها را شناسایی کرد.
از مزیت های مهم روش PCR-RFLPمی توان به هزینه پایین و عدم نیاز به تجهیزات پیشرفته اشاره کرد. علاوه بر این طراحی آنالیز های PCR-RFLP عموما آسان است و می توان با بکارگیری برنامهای عمومی در دسترس آن را انجام داد]5.[
کاربردها: PCR-RFLP یک روش بسیار با ارزش برای ژنوتایپینگ تنوع ویژه گونهها می باشد این روش معمولترین مرجع استاندارد بکار رفته برای ژنوتایپینگ فاکتور V leiden و پروترومبین G20210A میباشد. این روش همینطور برای یک سری اهداف شامل تشخیص آلل JK وابسته به فنوتیپ Kidd-null و تشخیص آلل آپولیپوپروتئین E بکار میرود. در کنار با ارزش بودن این روش برای تشخیص فرا گونه ای این روش برای شناسایی گونه ها وتفاوت هایشان بسیار پر کاربرد است]5[ از دیگر کاربردهای مهم این روش میتوان به این موارد اشاره کرد:
در موارد نژاد شناسی و موارد جنایی برای تعیین منشا نمونه DNA
برای تشخیص وضعیت بیماری در یک فرد
برای تعیین میزان نوترکیبی
1-14روش های آنالیز برای مطالعات وابستگی SNP
ژنوتیپ های به دست آمده از نمونه ها و کنترل ها را می توان در یک جدول احتمال 2×3 شمارش ژنوتیپ برای هر گروه خلاصه کرد. به عنوان مثال برای یک snp با آلل های G و T ما نمونهها و کنترلها را با ژنوتیپ GG وGT و TT جدولبندی کردیم. چندین روش آنالیز آماری مختلف برای این جدول میتواند به کار رود که در اینجا تمرکز ما بیشتر بر میزان تطابق است تا روشهای رگرسیون. آزمون کایاسکوئر پیرسون برای دستیابی به انحراف از فرضیه صفر بکار می رود که نمونه ها و شاهد ها توزیع مشابهی از تعداد ژنوتیپ دارند این آزمون آماری یک توزیع آماری کای اسکوئر با درجه آزادی 2 برای این جدول است.
این روش یک آنالیز آماری معتبر را برای اطلاعات موجود محیا می کند اما از اطلاعات ژنتیکی استفاده نمی کند. ما اطلاعات را در جدول با ژنوتیپ های GG، GT، TT نشان می دهیم اگر چه ترتیب ستون در این آزمون آماری مهم نیست و اگر جدول را به گونه ای دیگر نیز بچینیم مقادیر مشابهی از آزمون آماری و ارزش p بدست می آوریم.
جدول می تواند با شمارش تعداد الل های G و تعداد الل های T که توسط نمونه ها و شاهد ها حمل می شوند از ژنوتیپ به آلل تجزیه شود ( شکل 8-1چپ بالا) این آزمون تحت فرضیه صفر معتبر است یک روش جایگزین برای این مدل تست کوچران-آرمیتاژ است که برای گرایش به کار می رود (شکل 8-1 راست بالا) که آنچنانکه از نامش پیداست این آزمون برای سنجش یک گرایش در تفاوت نمونه ها و شاهد ها بکار می رود این آزمون به طور موازی با آزمون آلل است که قبلا توضیح دادیم. آزمون های بیشتری می توانند برای سنجش یک فرضیه ژنتیکی بکار روند برای مثال آلل های SNP افزایش دهنده ریسک یک بیماری تحت یک مدل غالب و یا مغلوب سنجیده می شود. علی رغم اینکه همه آزمون هایی که برای آنالیز مطالعات وابستگی تشریح شد معتبر هستند برای هر مطالعه می بایست یک برنامه آنالیز از پیش تعیین شده داشت زیرا بکار بردن همه این آنالیز ها احتمال نتایج مثبت غلط را افزایش می دهد]18[.
شکل 8-1 روش های آنالیز برای مطالعات وابستگی SNP ]18[
1-15 اهمیت موضوع
VUR اولیه یکی از مهمترین اختلالات مادرزادی است و شایع ترین بیماری ارثی سیستم ادراری-تناسلی است که باعث افزایش استعداد به عفونت ادراری در شیرخواران می شود و همچنین خطر ایجاد اسکار کلیوی را افزایش می دهد. در 60-30 % موارد، VUR و عفونت ادراری مکرر و بدون درمان مناسب، اسکار کلیوی مشاهده شده است . اسکار کلیوی مستقیما با افزایش احتمال خطر ریفلاکس نفروپاتی، پر فشاری خون و در نهایت نارسایی کلیوی در آینده همراه می باشد و به همین علت تشخیص به موقع و مدیریت مناسب ریفلاکس و عفونت های ادراری از اهمیت بسیار زیادی برای پیشگیری از عواقب مذکور برخوردار است. ریفلاکس نفروپاتی تقریبا در 25 درصد اطفال تحت دیالیز و 15-10 درصد بالغین در انتظار پیوند کلیه مشاهده می گردد.
این بیماری که به عنوان یک بیماری فامیلیال و ژنتیک شناخته شده، انتقال آن از طریق اتوزومال غالب می باشد و در 50-30 درصد شیرخواران با عفونت ادراری و در بیش از 10 درصد نوزادان با هیدرونفروز مادرزادی دیده می شود . تقریبا 35 درصد خواهران و برادران کودکان مبتلا به ریفلاکس نیز دارای این بیماری هستند و همچنین در نیمی از خواهر و برادران تازه متولد شده هم ریفلاکس دیده می شود و این احتمال به درجه ریفلاکس و جنس بیمار بستگی ندارد. 50 درصد فرزندان زنانی که مبتلا به ریفلاکس هستند نیز ریفلاکس دارند. حدود 12 درصد خواهران و برادران بدون علامت که مبتلا به ریفلاکس هستند، اسکار کلیوی دارند. بنابراین (VCUG) یا سیستوگرافی رادیو نوکلوِیید در تمامی خواهران و برادران 3 ساله یا کمتر کودکانی که ریفلاکس وزیکویورترال دارند و یا بالاتر از 3 سالی که سابقه عفونت ادراری (UTI) دارند و همچنین در کلیه فرزندان مادرانی که سابقه VUR در کودکی را داشته اند، توصیه می شود . هرچه سن بروز UTI کمتر باشد، احتمال همراهی آن با ریفلاکس بیشتر است، به طوری که در 70 درصد بچه های زیر یک سال، 25 درصد از کودکان کمتر از 4 سال و 15 درصد از اطفال 12-4 سال، این همراهی مشاهده می گردد.
VCUG و DRC نیازمند سونداژ و وارد کردن ماده حاجب و تصویربرداری مجاری فوقانی و تحتانی ادراری است که ممکن است کودکان به علت سونداژ دچار ترومای روانی یا هیجانی شوند. آماده سازی دقیق توسط مراقبین با تجویز داروهای خواب آور، قبل از انجام این عمل می تواند باعث کاهش اثرات این تجربه دردناک شود. با توجه به اهمیت تشخیص و درمان هرچه سریع تر VUR و با توجه به اینکه VUR یک اختلال ژنتیکی است و انجام VCUG یا DRC روشی ناخوشایند برای کودکان و والدین آنهاست، لذا این مطالعه، به منظور بررسی ارتباط پلی مرفیسم T509C- ژن TGF-β1 با VUR انجام شده است تا مشخص کنند که آیا می توان با بررسی آن در بیمار و خواهر و برادران وی احتمال وجود VUR را مطرح کرد یا خیر؟
1-16 فرضیه های مطالعه
1- احتمالا ژن TGF-β1به عنوان یک مارکر ژ‍نتیکی برای بیماران VUR مطرح باشد.
2- احتمالا ژنوتیپ TT در بررسی پلی مورفیسم T509C- ژن TGF-β1 به عنوان ریسک فاکتور برای بیماران VUR باشد.
3- احتمالا ژنوتیپ CT در بررسی پلی مورفیسم T509C- ژن TGF-β1 به عنوان ریسک فاکتور برای بیماران VUR باشد.
4- احتمالا ژنوتیپ CC در بررسی پلی مورفیسم T509C- ژن TGF-β1 به عنوان ریسک فاکتور برای بیماران VUR باشد.
5- احتمالا آلل T509 -بیشتری در کروموزوم های بیماران VURدر مقایسه با کروموزوم های گروه کنترل وجود دارد.
6- احتمالا آلل C509 -بیشتری در کروموزوم های بیماران VUR در مقایسه با کروموزوم های گروه کنترل وجود دارد.