– پس از خروج لوله‌ها از بن ماری، مقدار 1700 میکرو لیتر کلرید سدیم 6/5 مولار به لوله‌های آزمایش اضافه شده، سپس به مدت 15 ثانیه با دست به شدت تکان داده شد.
– لوله‌های آزماش به مدت 20 دقیقه با سرعت 3000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. در این زمان در لوله آزمایش دو لایه به وجود می‌آید، لایه بالایی دارای DNA است که به کمک سمپلر به درون لوله آزمایش دیگری انتقال داده شد.
– هم حجم مایعی که انتقال داده شده است، کلروفرم اضافه و به آرامی چند بار تکان داده شد و به مدت 10 دقیقه با دور 3000 دور در دقیقه، سانتریفیوژ شد.
– در این مرحله دو فاز ایجاد می‌شود که فاز بالایی حاوی DNA است. با استفاده از سمپلر فاز بالایی برداشته شد و به لوله آزمایش دیگری انتقال داده شد. در این مرحله برای متراکم کردن DNA، به مقدار 1/0 حجم محلول، استات سدیم 2/3 مولار اضافه شد.
– دو برابر حجم محلول، اتانول مطلق کاملا سرد اضافه شد. اتانول مطلق برای آبگیری DNA و غلیظ‌تر شدن آن اضافه می‌شود. پس از اضافه کردن اتانول مطلق، لوله آزمایش به آرامی با دست تکان داده شد تا زمانی که کلاف DNA ظاهر شود.
3-3-3- ذخیرهDNA
بعد از این‌که کلافDNAتشکیل شد با استفاده از لوله‌های شیشه‌ای استریل (پیپت پاستور) به دقت برداشته شده و به داخل تیوب‌های استریل با حجم 5/1 میلی لیتر انتقال داده شد. در داخل تیوب استریل با توجه به کلاف مورد نظر مقدار 250-150 میکرو لیتر از آب مقطر دو بار تقطیر دیونیزه برای حل شدن و نگهداری DNA ریخته شد. برای اینکه کلافDNA بهتر حل شود، تیوب استریل به مدت 30-15 دقیقه در دمای 55 درجه سانتیگراد در بن ماری قرار داده شد. پس از اینکه DNA کاملاً در بافر حل شد، تیوپ‌های دارای DNA در دمای 20- درجه سانتی‌گراد ذخیره شدند.
3-3-4- تعیین ویژگی‌های کیفی DNA
برای تعیین کیفیت DNA استخراج شده از روش الکتروفورز ژل آگارز استفاده شد.
3-3-4-1- تعیین کمیت و کیفیتDNA به وسیله الکتروفورز ژل آگارز
در ابتدا محلول TBE(10X) با استفاده از مواد موجود درجدول 3-4 تهیه شده و در ظرفی دربسته درون یخچال نگهداری شد تا هنگام استفاده برای تهیه TBE(1X) مورد نیاز در تهیه ژل آگارز و تانک الکتروفورز رقیق سازی شود.
جدول 4-4- مواد محلول TBE(10X)
مواد مورد نیاز
مقدار مواد
تریس به یس
108 گرم
بوریک اسید
55 گرم
EDTA
5/7 گرم
برای تعیین کیفیت DNA استخراج شده از ژل آگارز 7/0 درصد استفاده شد. برای تهیه آگارز 7/0 درصد با توجه به حجمژل (طول ژل× عرض ژل× ضخامت ژل)، به مقدار لازم از پودر آگارز وزن‌کشی شده و با بافر TBE(1X) به حجم موردنظر رسانده شد. سپس تا رسیدن به دمای جوش حرارت داده شد، به شیوه‌ای که رنگ محلول کاملا شفاف شود. بعد از آن که محلول به اندازه کافی خنک شد و دمای آن به 40 تا 50 درجه سانتی‌گراد رسید، در سینی ژل که از پیش آماده شده بود، ریخته شد تا ژل کاملا ببندد. بعد از جدا کردن شانه و شکل گیری چاهک‌ها، سینی حاوی ژل در تانک الکتروفورز که آن نیز دارای بافر TBE(1X) بود قرار داده شد. برای بار کردن نمونه‌ها در داخل هر چاهک، 2 میکرولیتر از DNA استخراج شده با 1 میکرولیتر بافر بارگذاری مخلوط شده و داخل چاهک‌ها ریخته شد.
بافر بارگذاری دو کار مهم انجام می‌دهد. اول اینکه چون دارای گلیسرول است، نمونه‌های DNAرا سنگین‌تر از تامپون الکترود (1X)TBE نموده و باعث می‌شود نمونه‌های DNA در ته چاهک‌ها قرار گیرند. دوم اینکه به دلیل رنگی بودن محلول فوق، امکان ردیابی DNA در جریان الکتروفورز وجود دارد.