دستگاه الکتروفورز به دستگاه تأمین نیروی برق متصل و الکتروفورز با ولتاژ ثابت 85 ولت انجام شد. نمونه‌ها به مدت 45 تا 55 دقیقه داخل ژل آگارز موجود در تانک حرکت کردند (برای حرکت نمونه‌ها از قطب منفی به قطب مثبت می‌باشد). سپس ژل از تانک الکتروفورز برداشته و به مدت 5 دقیقه داخل محلول اتیدیوم بروماید قرار گرفت. برای مشاهده باندها و تعیین کیفیت DNA، ژل به دستگاه مستندسازی ژل منتقل شده و از آن عکس تهیه شد.
3-3-4-2- تعیین کمیت و کیفیت DNA با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتری
ابتدا در کوت دستگاه اسپکتروفوتومتر آب دو بار تقطیر شده استریل (حلال نمونه‌هایDNA استخراجی) ریخته شد و دستگاه در طول موج‌های 260 و 280 نانومتر کالیبره شد. سپس حجم مشخصی از DNA بسته به ضریب رقت، با حجم مشخصی آب دوبار تقطیر شده استریل رقیق و درون کوت ریخته شد. شدت نور در طول موج‌های 260 و 280 نانومتر اندازه‌گیری شد و در نهایت غلظت DNA، میزان آلودگی پروتئینی و میزان خلوص DNA برآورد شد.
به طور کلی برای اندازه‌گیری غلظت DNA دو رشته‌ای از فرمول زیر استفاده می‌شود.
معادله 3-1:
مقدار جذب نور در nm260 × 50 × ضریب رقت = غلظت DNA (میکروگرم در میلی‌لیتر)
با توجه به نسبت جذب نور در طول موج‌های 260 و 280 نانومتر، می‌توان کیفیتDNA و خلوص آن را تخمین زد ((OD260/OD280 چنان‌چه این نسبت بین 95/1-85/1 باشد، کیفیت و خلوص DNA در بهترین حالت است. آلودگی‌های پروتئینی باعث کاهش این نسبت و وجود RNA زیاد در نمونه، باعث افزایش آن می‌شود.
3-4- واکنش زنجیره‌ای پلی مراز (PCR)
در این واکنش قطعه مورد نظر برای بررسی وجود چند شکلی، با استفاده از آغازگرهای اختصاصی تکثیر شد.
3-4-1- پروتکل و مواد مورد استفاده در PCR
اجزای واکنش زنجیره‌ای پلی مراز و نقش هر یک از آن‌ها به شرح زیر می‌باشد:
– DNA الگو که قطعه مورد نظر از روی آن تکثیر می‌شود.
– دو قطعه آغازگر که به دو سر ׳3 یا ׳5 DNA الگو متصل می‌شوند.
– DNA پلی‌مراز مقاوم به حرارت که وظیفه آن گسترش رشته جدید به وسیله دزوکسی نوکلئوتیدها می‌باشد.
– دزوکسی نوکلئوتیدهای سه فسفاته که اجزای سازنده DNA رشته جدید هستند.
– محلول بافر که محیط مناسبی را برای فعالیت و پایداری پلی مراز و خود DNA فراهم می‌آورد.
– کلرید منیزیم که در این واکنش به عنوان سیمان اتصال دهنده بلوک‌های همانند سازی یا همان dNTP ها عمل می‌کند.
لازم به ذکر است که تمامی مواد مورد نیاز به جز آغازگرها از شرکت سیناژن تهیه شدند. توالی آغازگرهای استفاده شده در این پژوهش برای هر کدام از نشانگرها در جدول 3-5 آمده است.
جدول 3-5- توالی آغازگرهای استفاده شده در این پژوهش
منبع
دمای اتصال
جایگاه