*دمای اتصال مربوط به هر آغازگر در جدول 3-5 ذکر شد.
3-5- الکتروفورز محصولات PCR روی ژل آگارز
محصولات PCR برای جایگاه‌های مورد نظر روی ژل آگارز 5/1٪ الکتروفورز شدند. مقدار 5 میکرولیتر محصول PCR با 2 میکرولیتر بافر بارگذاری به خوبی مخلوط شده و در چاهک‌ها ریخته شد. برای اطمینان از تکثیر قطعه مورد نظر، مقدار 2 میکرولیتر شاخص تعیین اندازه مولکولی با نام تجاری سایز مارکر 500 جفت بازی محصول شرکت Fermentas در چاهک میانی ژل بارگذاری شد. الکتروفورز محصولات PCR به مدت 45 دقیقه با ولتاژ 85 ولت انجام شد. پس از الکتروفورز ژل به مدت 5 دقیقه برای رنگ آمیزی در محلول اتیدیوم بروماید قرار داده شد. در نهایت برای مشاهده باندها، از دستگاه مستند سازی ژل استفاده شد.
3-6- تعیین ژنوتیپ محصولات PCR ژن مورد نظرروی ژل پلی‌اکریلآمید
3-6-1- تهیه ژل پلی‌اکریل‌آمید
برای مشاهده قطعات حاصل از PCR ژن‌های مورد مطالعه از ژل پلی‌اکریلامید 8% استفاده شد. مواد لازم برای تهیه‌ی65 میلی لیتر ژل پلی‌اکریل‌آمید 10% در جدول 3-8 آمده است.
جدول 3-8- مواد لازم برای تهیه ژل پلی‌اکریل‌آمید
مواد استفاده شده
مقدار مواد
پلی‌اکریل‌آمید (5/38 درصد)
17 میلی لیتر
TBE (1X)
48 میلی لیتر
APS (10%)
TEMED
650 میکرو لیتر
70 میکرو لیتر
در این پژوهش از دستگاه الکتروفورز عمودی مدل VSTA-1002M استفاده شد. قطر ژل در این پژوهش 2 میلی‌متر و ابعاد ژل 35×25 سانتی‌متر بوده است. ابتدا شیشه‌های مخصوص آن کاملا با آب شسته و به الکل آغشته و سپس با یک دستمال عاری از هر گونه کرک و آلودگی خشک شد. فضاسازهایآغشته به وازلین روی شیشه زیرین قرار داده شد و سپس شیشه رویی نیز روی فضا سازها و شیشه زیرین قرار گرفت. برای این‌که دو شیشه به همراه فضاسازها خوب به همدیگر بچسبند از گیره‌های مخصوص استفاده شد.
محلول آماده شده با دقت داخل شیشه مخصوص تانک عمودی الکتروفورز ریخته و سپس شانه مخصوص به آرامی داخل شیشه و روی ژل قرار داده شد. به گونه‌ای که از تشکیل حباب در زیر شانه جلوگیری شود. زیرا مانعی جهت حرکت باندها در داخل ژل به خوبی حرکت نکنند. همچنین در هنگام ریختن ژل درون شیشه‌ها باید به این نکته مهم توجه کرد که مواد به صورت یکنواخت حل شده باشند، در صورت یکنواخت نبودن محلول، کمانی شدن حرکت باندها روی ژل مشاهده می‌شود. پس از تزریق محلول ژل به داخل شیشه‌ها مدتی صبر کرده تا ژل درون شیشه ببندد. سپس شیشه در یخچال قرار داده شد تا ژل خنک شود و چاهک‌هابه خوبی شکل بگیرند.
بعد از قرار گرفتن ژل در تانک عمودی 5 میکرولیتر از محصول PCR با 7 میکرولیتر از بافر بارگذاری مخلوط و داخل چاهک‌هاریخته شد (برای SSCP محصول PCR را به همراه بافر به مدت 10 دقیقه داخل دستگاه PCR با دمای 90 درجه سانتی گراد قرار داده تا DNA تک رشته ای شود). ژل اکریلامید به مدت 18 ساعت با ولتاژ 400 و در دمای 4 درجه سانتی گراد الکتروفورز شد.
3-6-2- محلول‌های مورد نیاز برای رنگ آمیزی ژل پلی‌اکریل‌آمید
3-6-2-1- رنگ آمیزی با نیترات نقره