در انجام این روش باید به فاکتور‌ها ی زیر توجه کرد تا روی نتایج اثر نگذارد0
1-3-2-3-1- آگار
عمق آگار: آگار را ممکن است در پلیت‌ها ی خیلی نازک تقسیم نمایند.لایه‌ها ی نازک ایجاد‌ها له بزرگ تر می‌کنند.اکثر محققین لایه‌ها ی بین 3-5 میلی متر را مناسب می‌دانند.به طور کلی مشخص نمودن بهترین ضخامت از آگار در پلیت‌ها و به کار بردن آن در تعیین مقدارچندان مهم نیست بلکه باید توجه داشت که در یکسری آزمایش تمام پلیت‌ها به یک ضخامت پر شده باشند.بدین منظور باید پلیت‌هایی یک اندازه با کف مسطح انتخاب کرده ویک حجم معین از آگار را در هر یک از آنها ریخت.
خشکی آگار: اگر ژل آگار به حد کافی خشک نباشد باعث ایجاد‌ها له‌ها یی با کناره‌ها ی نا مشخص می‌شود.برخی از محققین عقیده دارندکه خشک کردن از کارهای اساسی است.در صورتیکه برخی دیگر از خشک کردن خودداری و صرف نظر می‌کنند.نتیجه این دو بررسی نشان داده است که اگر آگار کمی‌ خشک باشد‌ها له‌ها بهتر ظاهر خواهند شد.در موقع خشک کردن باید توجه داشت که از ورود آلودگی هوا جلوگیری شود و با برگرداندن پلیت‌ها روی در آنهامی‌توان این مشکل را حل نمود.خشک کردن را می‌توان در حرارت محیط یا با قرار دادن در گرمخانهای که حرارت آن را زیادتر کرده باشندانجام داد. مدت زمان لازم جهت خشک کردن بستگی به رطوبت آگار دارد.
مقدار آگار: عده ای معتقدند حساسیت روش انتشار با کم کردن مقدار آگاردر محیط کشت زیادتر می‌شود.در هر صورت مقدار آگار به کار رفته در اندازه گیری موثر است.
pH آگار: منظور اصلی این است که در حدودی مناسب،‌ بهترین pH اپتیمم برای رشد میکروارگانیسم‌ها انتخاب شود. زیرا قطر‌ها له‌ها با تغییر pH آگار تغییر می‌یابد.
1-3-2-3-2- شرایط کشت در گرمخانه
این شرایط شامل زمان و حرارت مناسب جهت انکوباسیون است که بسته به میکروب و موارد مورد سنجش متفاوت است.میزان انتشار مواد بوسیله‌ها له‌ها ی ایجاد شده مشخص می‌شود که این خود بستگی به میزان رشد میکروب آزمایشی دارد و فعالیت ماده فقط بوسیله میزان انتشار مواد قبل از شروع تکثیر میکروارگانیسم اندازه گیری می‌شود.
1-3-2-3-3- طرز قرار گرفتن ارگانیسم روی آگار
1-3-2-3-4- مواد مورد آزمایش(ماده آنتی باکتریال)
خصوصیات ماده ای که برای تعیین مقدار آزمایش می‌شود بایستی به شرح زیر باشد: دارای اثر محرکه یا جلوگیری کننده نسبت به میکروارگانیسم باشد.در حلالی قابل انحلال باشدکه در غلظت مصرف شده با اندازه‌گیری تداخل نداشته باشد.
انتخاب مقدار لازم از ماده اندازه گیری شونده بستگی به فعالیت آن ماده نسبت به میکروارگانیسم مورد نظر دارد[35 ] .
1-4- عوامل موثر بر کشت میکروارگانیسم‌ها
همانطور که قبلا توضیح داده شد در اینجا ما بر روی میکروب‌ها ی اشیریشیاکلی،‌سالمونلا تیفی، هلیکوباکتر پیلوری،‌ ویبریو کلرا، لیستریا مونوسیتوجنزو شیگلاسونئی بررسی میکرو بیولوژیکی انجام می‌دهیم.در بررسی میکروارگانیسم‌ها باید عوامل زیر را در نظر بگیریم:
1-4-1- سن وشرایط کشت
کشت را باید در شرایطی نگهداری نمود که در تمام مواردی که آن را برای سنجش به کار می‌برندنتیجه یکسان حاصل شود.در مورد اندازه گیری‌ها یی که کشت را به مدت یک شب در گرمخانه قرار می‌دهندسن ارگانیسم‌ها ممکن است بین 18-24 ساعت بوده،‌ بنابراین در این مورد مرحله وقفه کمتر اهمیت دارد.کشت‌ها ی کهنه به دلایل زیر برای آزمایش مناسب نمی‌باشند:
1- فزونی میکروب‌ها ی مرده باعث رشد نا کافی خواهد شد.
2- تغییر در فاکتور‌ها ی لازم برای رشدو تغییر در حساسیت نسبت به مواد ضد میکروبی.
3- استاندارد نبودن مقدار میکروب به علت تغییراتی در تعداد سلول‌ها ی زنده.
4- امکان اتولیز و آزاد شدن موادی که ممکن است با اندازه گیری تداخل داشته باشند.
نکته مهم دیگری که در مورد کشت ذخیره باید در نظر داشت خلوص آن است.با مصرف کشت آلوده ممکن است نتایج مختلف بدست آید.
1-4-2- مقدار میکروب
عدم کنترل میکروارگانیسم مورد مصرف در سنجش روزانه ممکن است باعث پیدا شدن اختلاف در اندازه گیری یک ماده مشخص شود.در اندازه گیری با روش انتشار،‌در مورد آنتی بیوتیک‌ها،‌غلظت میکروبی یا مقدار میکروبی که به کار می‌رود بر روی قطر‌ها له‌ها ی بدست آمده موثر است وتغییرات در مقدار میکروب متناسب با تغییرات در اندازه قطر‌ها له‌ها است[36 ] .
1-4-3- درجه حرارت وارتباط آن