جهت رفع آلودگی و استقرار اولیه گیاه پپرومیا درون شیشه از شاخههای حاوی 2 تا 3 جوانه جانبی استفاده گردید. کلیه مراحل ابتدایی ضدعفونی برای همه تیمارها مشابه و یکسان در نظر گرفته شد و این مراحل شامل این موارد بود: آبشویی با آب جاری به مدت 30 دقیقه، قرار دادن نمونهها در محلول حاوی مایع ظرفشویی به مدت 15 دقیقه، آبشویی با آب جاری به مدت 15 دقیقه بدون هیچگونه ماده شوینده، ضدعفونی با الکل 70% به مدت 60 ثانیه و سپس سه مرتبه آبشویی. سپس تیمارهای ضدعفونی اعمال شده و پس از 3 مرتبه آبشویی با آب استریل نمونهها کشت گردیدند. روشهای ضدعفونی استفاده شده در این آزمایش شامل وایتکس 20% به مدت 40 دقیقه، وایتکس40% به مدت 15 دقیقه، قارچکش کاپتان به میزان 5/0 گرم در لیتر به مدت 15 دقیقه و کلریدجیوه 1/0% به مدت 7 دقیقه بودند. در هر شیشه مک کارتی، یک ریزنمونه قرار داده شد. محیط کشت استفاده شده MS حاوی 20 گرم در لیتر ساکارز، 3 میلیگرم در لیتر هورمون IAA و 75/0 میلیگرم هورمون 2IP بود. هر تیمار دارای 4 تکرار و هر تکرار شامل 4 نمونه بود. کشتها در شرایط 25 درجه سانتیگراد در اتاق کشت با فتوپریود 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی و دمای 25 درجه سانتیگراد قرار گرفتند. 10 روز پس از کشت ریزنمونهها میزان و نوع آلودگی اعم از باکتریایی و قارچی مشخص و یادداشتبرداری گردید و اطلاعات بدست آمده به صورت طرح کاملا تصادفی توسط نرمافزار SAS تجزیه آماری شد (شکل 3-4) (شکل 3-5).
3-9 بررسی تاثیر افزایش غلظت فسفر بر اندامزایی پپرومیا
در این آزمایش مقدار فسفر محیط MS به دو برابر افزایش یافت و بقیه عناصر ماکرو و میکرو و ویتامینها و هورمونها بدون تغییر با نسبتهای مشخص شده در پروتکل محیط MS مورد استفاده قرار گرفت. ریزنمونههای گیاهی به صورت قطعات مربع شکل به ابعاد 1*1 سانتیمتر که از محل پهنک برگ گیاه پپرومیا برش داده شدند و کلیه مراحل ضدعفونی شامل الکل 70% به مدت 60 ثانیه، وایتکس 20% حاوی 5% کلر آزاد به مدت 30 دقیقه (به همراه دو قطره از محلول تویین) و 2 مرتبه آبشویی با آب مقطر استریل (کلیه مراحل در زیر هود لامینار) انجام شد و سپس درون شیشههای مککارتی که به میزان 10 سیسی محیط درون آن ریخته شده بود کشت داده شد. کشتها در شرایط 25 درجه سانتیگراد در اتاق کشت با فتوپریود 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی و دمای 25 درجه سانتیگراد قرار گرفتند.
3-10 اثر سطوح مختلف ساکارز بر اندامزایی پپرومیا
در این آزمایش قند موجود در محیط MS به سه سطح به شرح زیر تغییر داده شد، ولی بقیه عناصر محیط کشت و مراحل مختلف ضدعفونی و نیز گیاه ثابت و بدون تغییر بودند (جدول 3- 2):
جدول 3-1 مقادیر قند به کار رفته در محیط کشت
مقادیر
ساکارز
در محیط 20 گرم در لیتر
40 گرم در لیتر
80 گرم در لیتر
ریزنمونههای گیاهی به صورت قطعات مربع شکل به ابعاد 1*1 تر که از محل پهنک برگ گیاه پپرومیا و نیز قطعات یک سانتیمتری از دمبرگ گیاه و از محل میانی دمبرگ برش داده شدند و کلیه مراحل ضدعفونی شامل آبشویی به مدت 30 دقیقه با آب جاری، الکل 70% به مدت 60 ثانیه، وایتکس 20% حاوی 5% کلر آزاد به مدت 30 دقیقه (به همراه دو قطره از محلول تویین) و 2 مرتبه آبشویی با آب مقطر استریل (کلیه مراحل در زیر هود لامینار) انجام شد و سپس کشت داده شد. کشتها در شرایط 25 درجه سانتیگراد در اتاق کشت با فتوپریود 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی و دمای 25 درجه سانتیگراد قرار گرفتند.
3-11 تاثیر سطوح هورمونی و تلقیح با باکتری بر رشد ریزنمونه جوانه جانبی درون شیشه
در این آزمایش جوانههای جانبی گیاه پپرومیا که ضدعفونی و آماده کشت شده بودند درون محیطهای از قبل آماده شده که بر سطح آن باکتریهای مورد استفاده در آزمایش تلقیح شده بود کشت گردیدند. آزمایش با هدف بررسی تاثیر مقادیر هورمون و تلقیح با باکتری بر رشد جوانه جانبی انجام شد طرح بصورت فاکتوربل در قالب کاملا تصادفی با 3 تکرار و در هر تکرار 7 نمونه صورت گرفت. فاکتورها عبارت بودند از:
فاکتور اول: تلقیح با باکتری شامل سه سطح
شاهد (بدون باکتری)
Azospirillum lipoferum
Pseudomonas fluorescent
فاکتور دوم: سطوح هورمون شامل سه سطح
شاهد (بدون هورمون)
2IP 0.5 mg/l + IAA 0.2 mg/l
غلظت دو برابر تیمار قبلی
در این آزمایش جوانههای جانبی گیاه پپرومیا که از گلدان جداسازی و ضدعفونی شده بودند در محیط MS حاوی مقادیر هورمون به شرح فوق و تلقیح شده با باکتری درون شیشههای مک کارتی کشت شدند. روش تهیه تیمارهای هورمونی و باکتریایی در قسمتهای قبلی توضیح داده شدند.
3- 12 تاثیر تلقیح با باکتری بر سازگاری گیاهان تکامل یافته در گلدان