تکنیک کشت بافت گیاهی نقش کلیدی در انقلاب سبز دوم دارد که در این انقلاب تغییرات ژنی و بیوتکنولوژی جهت پیشرفت کیفیت و کمیت محصولات زراعی بکار میروند. این تکنولوژی برای محدوده وسیعی از گیاهان زراعی و گونههای درختی جهت حل مشکلات بکار گرفته شده است. این روش بواسطه تلاشهای مداوم و پیگیر تعداد زیادی از دانشمندان که کارهای پایهای انجام دادهاند، ممکن شده است. کشت بافت گیاهی اصطلاحی است که بطور کلی برای رشد درون شیشهای و عاری از بیماری گیاه بر روی محیط مغذی بکار میرود. این تکنولوژی بر سه اصل اساسی استوار است (باقری و همکاران، 1381):
قسمتی که باید از گیاه اصلی جدا شود.
ریزنمونه باید در شرایط شیمیایی (محیط کشت) و فیزیکی (محیطی) تعریف شده نگهداری شود.
شرایط استریل و عاری از آلودگی باید حفظ شود

شکل 1-1 گیاه پپرومیا (برگ قاشقی)
دانش امروزی اجازه بکارگیری هر قسمت از گیاه را برای شروع کشت میدهد. قسمتی از گیاه که برای این منظور بکار میرود ریزنمونه نامیده میشود. انتخاب هر قسمت از گیاه با توجه به هدف از کشت متفاوت است. مواد و نمونههایی که از محیط خارج جمعآوری و به آزمایشگاه آورده میشوند، در حین انتقال، بهتر است در شرایط مناسب نگهداری شوند تا فعالیتهای کاتابولیکی به حداقل برسد. مواد بطور کامل باید با آب جاری و مایع شوینده شستشو داده شوند (مانند تویین-80 )، بعد از شستشو و حذف ذرات چسبنده بسته به نوع ریزنمونه مراحل استریل انجام شده و سپس کشت انجام میشود. کشت بافت گیاهی یا کشت درون شیشهای عبارت است از رشد سلول، بافت و یا اندام گیاهی در یک محیط غذایی مصنوعی استریل که به صورت جامد یا مایع تهیه میشود، این روش به عنوان یکی از شاخههای زیستفناوری، کاربرد گستردهای در کشاورزی دارد. در کشت بافت، قسمتی از گیاه به نام قلمه یا ریزنمونه که ممکن است بخشی از ساقه، برگ، جوانه و یا یک سلول باشد، در محیط کنترل شده کشت میشود. در این نوع کشت، شرایط به گونهای است که عاری از هرگونه میکروارگانیسم بوده و رژیم متعادلی از مواد شیمیایی و آلی مورد نیاز رشد گیاه فراهم است. در واقع در کشت درون شیشهای محیط کشت بستری برای رشد گیاه است و ترکیبی از مواد شیمیایی و آلی در یک ژل مغذی یا محیط مایع برای رشد سلولها و بافتها میباشد (شریفی و همکاران، 1389).
در سال 1838 شوان و شیلدن نظریۀ توتیپوتنسی را ارائه نمودند. براساس این نظریه، هر سلول گیاهی، هنگامی که در محیط غذایی مصنوعی و شرایط مناسب کشت شود، میتواند به گیاهی جدید و کامل تبدیل شود. بعدها دانشمند آلمانی، هابرلند (1902) برای اولین بار به بررسی این نظریه پرداخت و ادعا کرد که اگر محیط و تغذیه سلولهای کشت شده مناسب باشند، سلولهای کشت شده میتوانند، گیاهان نرمالی را بوجود آورند. اما تلاشهای او در انجام کشت بافت ناموفق بود. او همچنین معتقد بود که قطعه قطعه کردن نامحدود بافتهای گیاهی بر روی قدرت تکثیر سلولها تأثیر نمیگذارد. او استفاده از مایع موجود در کیسه جنینی و تولید جنینهای مصنوعی را از سلولهای رویشی پیشنهاد کرد (احمدیان، 1380). به دلیل تاخیر در کشف هورمونهای گیاهی، کشت بافت گیاهی پس از کشت بافت حیوانی و انسانی شروع شد. اولین کشت موفقیتآمیز بافتهای گیاهی، توسط وایت در سال 1934 انجام شد. او در سال 1939 اولین کشت موفقیتآمیز کالوس هویج و توتون را گزارش کرد. اولین هورمون تنظیمکننده رشد که کشف شد، اکسین بود که موفقیت بزرگی را برای کشت بافت در شرایط درون شیشهای به همراه داشت. بعد از کشف تنظیمکننده رشد کینتین در سال 1955، انگیزه بیشتری برای کشت بافت حاصل شد. بزرگترین مشوق برای استفاده از فنون کشت بافت گیاهی برای تکثیر بسیاری از گونهها، ممکن است کار اولیه مورل روی تکثیر ارکیده و کار موراشیگ و اسکوگ در 1964 در ایجاد محیط کشت جدیدی با غلظت بالای نمکهای معدنی بوده باشد (احمدیان، 1380).
1-4 ترکیبات محیطهای کشت
محیط کشت یکی از مهمترین اجزاء کشت یاخته و بافت گیاهی است. کاربرد موفق فنون کشت بافت گیاهی به میزان زیادی به محیط کشتی با ترکیب صحیح بستگی دارد. ترکیب محیطهای کشت به روش خاص کشت به کار رفته تغییر مییابد. برای نمونه روشهایی مانند باززایی گیاهان کامل از یاختهها یا بافتها نیازمند محیطهای کشتی با ترکیبات مختلف برای آغازش هریک از مراحل توالی تکوینی است. علاوه بر ترکیب آن، نقش مهم دیگر محیط کشت فراهم کردن محیط فیزیکی مناسب برای یاختهها و بافتها برای رشد میباشد. برای نمونه محیطهای کشت جامد، نقشی شبیه خاک را از طریق فراهم کردن یک زمینه و حامل فیزیکی که ریزنمونههای بافت بتوانند تماس با هوا را برای تبادل گاز حفظ نمایند یا جایی که گیاهچههای باززایی شده بتوانند ریشه دهند، ایفا میکنند. از سوی دیگر، کشتهای تعلیقی در حال رشد در کشت مایع در حال تکان خوردن، یاختهها را قادر میسازد تا حداکثر تماس را با اجزای محیط کشت حفظ کنند و تبادل گازها تسهیل شود. تمام یاختههای گیاهی زنده برای حفظ و رشد و نمو نیازمند آب، عناصر غذایی (عناصر معدنی و ترکیبات آلی) و تنظیمکنندههای رشد گیاهی (هورمونها) هستند. ترکیبات محیطهای کشت بافت گیاهی معمولا این نیازمندیها را منعکس میسازند و چندین ترکیب اختصاصی (مانند محیط کشت موراشیک و اسکوگ یا محیط ام. اس) که به طور رایج برای کشت به کار میروند دارای ترکیبات پایه مشابهی هستند. مواد مورد نیاز برای کشت یاخته گیاهی را میتوان به سه گروه تقسیم کرد که عبارتند از: عناصر غذایی معدنی، عناصر غذایی آلی و تنظیمکنندههای رشد گیاهی (باقری و همکاران، 1383؛ شریفی و همکاران، 1389).
1– 4 – 1 مواد غیر آلی
عناصر غذایی غیر آلی، عناصر معدنی هستند و معمولا بر اساس غلظتهای ضروری به دو گروه تقسیم میشوند: عناصر پرمصرف که در مقادیر زیاد (غلظتهای میلیمول) و عناصر کممصرف که تنها در غلظتهای بسیار پایین (میکرومول) ضروری میباشند. عناصر پرمصرف شامل: نیتروژن، گوگرد، فسفر، کلسیم، منیزیم، پتاسیم و عناصر کممصرف شامل: آهن، بر، کبالت، مس، ید، منگنز، مولیبدن و روی هستند. عناصر غذایی آلی در حالی که گیاهان سبز خودپرور هستند، ولی بیشتر سیستمهای کشت حداقل در مراحل اولیه، خودناپرور میباشند و به یک منبع آلی کربن و انرژی نیازمند هستند. کشتها برای آغاز توسعه کلروپلاستها و فتوسنتز اغلب در روشنایی پرورش داده میشوند. علاوه بر یک منبع آلی از کربن و انرژی، کشتهای گیاهی ممکن است به مولکولهای آلی پیچیده برای رشد سالم نیز نیازمند میباشند (خسروشاهلی و همکاران، 1386).
1– 4– 2 منبع کربن
قندها برای تامین کربن و انرژی به محیطهای کشت گیاهی افزوده میشوند. ساکارز متداولترین قند مورد استفاده در محیطهای کشت گیاهی است، ولی گلوکز، فروکتوز و سوربیتول در برخی از محیطهای کشت مورد استفاده قرار میگیرند. علاوه بر نقش متابولیکی آن، ساکارز همچنین به عنوان یک اسمزنگهدار عمل میکند و همراه با عناصر غذایی معدنی به تعادل پتانسیل اسمزی محیط کشت کمک میکند (شریفی و همکاران، 1389).
1 – 4 – 3 ویتامینها
ویتامینهای افزوده شده، برای کشتهای یاخته و بافت گیاهی ضروری نیستند، هرچند ویتامین B1 (تیامین) برای کشتهای برخی از گونهها سودمند تشخیص داده شده است. با وجود این بیوتین، اسیدپانتوتنیک، اسیدنیکوتینیک (نیاسین)، پیریدوکسین (پیریدوکسول، ویتامین B6)، اسیدفولیک، اسیداسکوربیک (ویتامین C) و توکوفرول (ویتامین E) به برخی از محیطهای کشت افزوده میشود. افزودن انفرادی عصاره مخمر گاهی اوقات به عنوان منبع ویتامینها صورت میگیرد. الکل قند میواینوزیتول به وفور در محیطهای کشت برای گیاهان تک لپهای، بازدانگان و برخی از گیاهان دولپهای به کار میرود. این الکل قندی نقشی را در توسعه دیواده یاخته و غشاء ایفا میکند (باقری و همکاران، 1383).
1 – 4 – 4 آمینواسیدها و مکملهای آلی
آمینواسیدها هنگام کاهش نیتروژن نقش خود را ایفا میکنند. در صورت ناکافی بودن نیتروژن، مکمل نیتروژن آلی کمپلکس مانند کازئینهیدرولیزات (1-1/0 گرم بر لیتر) ممکن است افزوده شود. گلایسین آمینواسیدی است که عموما استفاده میشود. سایر مکملهای آلی عبارتند از شیر نارگیل، عصاره مخمر، پپتون و عصاره جو، هرچند محیطهای کشت مصنوعی ترجیح داده میشوند و مکملهای آلی که طبیعت شیمیایی ناشناخته دارند فقط در مواقع ضروری بکار میروند (ابراهیم زاده و همکاران، 1384).
1 – 4- 5 تنظیمکنندههای رشد گیاهی
پنج گروه اصلی از تنظیمکنندههای رشد گیاهی یا هورمونهایگیاهی وجود دارد که رشد و تمایزیابی در گیاه را هماهنگ میکنند و عبارتند از: اکسینها، سایتوکینینها، جیبرلینها، اسیدآبسزیک و اتیلن. اتیلن به طور عمده در ریزش، پیری گل و رسیدن میوه موثر است و به ندرت در کشتهای بافت گیاهی به کار میرود. از چهار گروه دیگر هورمونهای گیاهی، اکسینها و سایتوکینینها به وفور در کشتهای بافت گیاهی به کار میروند و جیبرلینها و اسید آبسزیک گهگاه مورد استفاده قرار میگیرند (خسروشاهلی و همکاران، 1386).

مطلب مرتبط :   دانلود پایان نامه ارشد با موضوع بهینه سازی و فیزیولوژی

1 – 4 – 6 عامل ژلهایکننده
برای کشت بافت نیاز به یک عامل جامدکننده محیطی است تا نمونه به راحتی روی آن قرار گیرد و از غوطهور شدن آن جلوگیری به عمل آید (جورج و همکاران، 1987).
1– 4 – 6 – 1 آگار