تیمارهای باکتریایی به شرح زیر بودند:
1- شاهد (بدون باکتری)
2- Azospirillum lipoferrum
3- Pseudomonas fluorescent
سویههای باکتریایی مورد نیاز شامل Azospirillum lipoferrum و نیز Pseudomonas fluorescent از بخش بیولوژی موسسه تحقیقات خاک و آب کشور واقع در کرج به صورت کشت مایع تهیه شد. مایه تلقیح باکتری در محیط کشت اختصاصی هر کدام از باکتریها در ارلنهای 150 میلیلیتر بر روی شیکر دورانی با 120 دور در دقیقه در دمای 25 درجه سانتیگراد کشت داده شد (شکل 3-1). پس از 72 ساعت تعداد باکتری در واحد حجم به روش شمارش کلونی شمارش شده و مقدار 08/0 میلی لیتر از باکتری (107c.f.u. m/l) در زیر هر ریزنمونه استفاده شد (لارابرو و همکاران، 2007). مایع تلقیح باکتریایی قبل از انجام کشت ریزنمونه درون شیشه (به سطح محیط کشت) و گلدان (به قسمت پایین ساقه) بوسیله سمپلر تلقیح شدند.

3-1 قرار دادن باکتریها بر روی شیکر جهت تهیه مایع تلقیح
3-4 ترکیبات و ساخت محیط کشت
محیط کشت پایه مورد استفاده در این آزمایشها، محیط MS (موراشیک و اسکوگ، 1962) به همراه 30 گرم در لیتر ساکاروز و 6 گرم بر لیتر آگار و همچنین هورمونهای رشد گیاهی بود. pH محیط برابر با 8/5 در نظر گرفته شد که باHCl برای اسیدیتر کردن محیط و NaOH برای قلیاییتر محیط کالیبره گردید. هورمونهای استفاده شده در این آزمایش شامل اکسین و سیتوکینین بودند. برای استفاده از هورمونها محلول مادری 100 برابر غلظت تهیه شد و تا موقع استفاده در یخچال نگهداری گردید. هورمونها که به صورت پودر بودند ابتدا در چند قطره NaOH حل شده و با آب به حجم محلول مادری رسیدند. جهت تهیه محیط کشت با توجه به تیمار و حجم محیط، مقدار مشخص از محلول مادری برداشته شده و محیط کشت به حجم مورد نظر رسید (شکل 3-2)

مطلب مرتبط :   پایان نامه ارشد درباره آستان قدس رضوی و دوره ایلخانی

3-2 ساخت محیط کشت و تنظیم pH محیط کشت
3-5 ضدعفونی ریزنمونههای گیاهی پپرومیا
آبشویی به مدت 15 الی 20 دقیقه در زیر آب جاری به همراه دو قطره مایع شوینده (مانند مایع ظرفشویی) به منظور زدودن آلودگیهای اولیه از سطح ریزنمونه انجام گردید (شکل 3-3). کاربرد اتانول 70% به مدت 60 ثانیه بر ریزنمونهها درون ظرفی با درب بسته و همراه با تکان دادن به منظور تماس بهتر الکل با همه قسمتها انجام شد. همچنین هیپوکلریت سدیم با 5% کلر فعال (وایتکس بدون بو) به همراه چند قطره از محلول تویین به مدت 15 الی 25 دقیقه بسته به بافت گیاهی مورد استفاده و میزان آلودگی و حساسیت بافت استفاده شده انجام گرفته و در نهایت سه مرتبه آبشویی با آب مقطر استریل انجام گرفت. کلیه مراحل بعد از آبشویی در زیر هود لامینار انجام پذیرفت.

3-3 انجام آبشویی قبل از استفاده از مواد شیمیایی برای ضدعفونی

3-4 شیشههای حاوی ریزنمونه پپرومیا
3-6 شرایط کشت ریزنمونهها
کلیه مراحل به صورت کاملا استریل و با رعایت اصول ایمنی آزمایشگاهی انجام گرفت که بعنوان مثال میتوان استفاده از لامپ UV در اتاق کشت به مدت 10 دقیقه قبل از شروع کار و همچنین ضدعفونی سطوح با الکل طبی و نیز ضدعفونی تمام وسایل و مواد مورد استفاده بوسیله اتوکلاو و رعایت اصول حرفهای کشت بافت هنگام کار در زیر هود لامینار و غیره را نام برد. ریزنمونه ضدعفونی شده آماده کشت با رعایت شرایط گفته شده طوری که به خوبی با محیط کشت در تماس باشد کشت داده شد. کشتها در شرایط 25 درجه سانتیگراد در اتاق کشت با فتوپریود 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی و دمای 25 درجه سانتیگراد قرار گرفتند.
3-7 کشت اولیه
بعد از تهیه گیاه مادری، کشت اولیه ریزنمونهها برای دستیابی به گیاهچههای کشت بافتی عاری از آلودگی انجام گرفت. جهت دستیابی به این هدف چندین آزمایش انجام شد که در ادامه توضیح داده میشوند. این آزمایشها با هدف اندامزایی گیاه پپرومیا و ایجاد شاخسارههای متعدد برای آزمایش اصلی (بررسی اثر باکتریها بر رشد گیاه) انجام شدند.

مطلب مرتبط :   تأثیر نقش والدین بر رشد و پیشرفت کودکان

3-5 نگهداری ریزنمونهها در شرایط مطلوب ایجاد شده در اتاق رشد
3-8 آزمایش بررسی اثر استفاده از تیمارهای مختلف گندزدایی در جلوگیری از آلودگی در کشت بافت گیاه پپرومیا