آگار متداولترین ژل مورد استفاده در کشت بافت گیاهی است. آگار، پلیساکارید پیچیدهای است که از جلبک قرمز استخراج شده است و از دو بخش آگارز (70 درصد) و آگاروپکتین (30 درصد) تشکیل شده است. آگارز بخش ژلساز بوده و شامل پلیمری از واحدهای مونوساکارید متناوب د-گالاکتوز و 3،6- آنیدروگالاکتوز است. آگار در دمای حدود 100 درجه سانتیگراد ذوب میشود و در دمای حدود 35 درجه سانتیگراد به حالت ژل در میآید. آگار پایدار است، با اجزای محیطهای کشت واکنش نمیدهد و به طور طبیعی توسط آنزیمهای گیاهی هضم نمیشود (ابراهیم زاده و همکاران، 1384).
1-5 ظروف کشت
نوع ظروف استفاده شده در کشت بافت اثرات قابل توجهی بر سرعت رشد کشتها، کیفیت ساقهها و گیاهچههای تولید شده و درجه ی شیشهای شدن دارد. در این مورد بویژه حجم ظرف، رطوبت هوا در فضای بالای کشت درون ظرف و میزان تبادل گازی با هوای بیرون ظرف اهمیت خاصی دارد (مک کون و سلمر ، 1987).
1 – 6 انتخاب و تهیه ریزنمونه
زمانی که گیاه دهنده ریزنمونه در گلخانه یا اتاقک رشد پرورش مییابند، گیاهان در تمام طول سال در مرحله مناسبی از رشد میتوانند در دسترس باشند. اما ریزنمونههای حاصل از درختان فقط زمانی برای ریزازدیادی در شرایط مطلوب هستند که به موقع جمعآوری شوند. نگهداری مواد گیاهی جمعآوری شده در زمان مناسب، طول دورهای را که از آن میتوان استفاده نمود افزایش میدهد (احمدیان، 1380).
1 – 7 ریزازدیادی
سه نوع اصلی ریزازدیادی عبارتاند از: 1- رشد طولی ساقه جانبی (پرآوری) 2- اندامزایی 3- جنینزایی
رشد طولی ساقه جانبی زمانی انجام میشود که جوانههای جانبی که بطور معمول غیرفعالاند، از غالبیت انتهایی رهایی یابند. این کار بیشتر از طریق تغییر هورمونها (اساساً سایتوکینینها) در محیط کشت غذایی اعمال میشود. برای رشد طولی ساقه جانبی، فراوانترین نوع ریزنمونه قطعات کوچک ساقه یا تک گره است. میزان تشکیل ساقه جانبی گاهی اوقات پس از چند واکشت افزایش مییابد (خسروشاهلی و همکاران، 1386).
در اندامزایی ساقههای نابجایی القاء میشوند که سپس ریشهدار میگردند. در این حالت به ندرت ریشهها قبل از ساقه ایجاد میشوند. در جنینزایی، جنینهای سوماتیکی از رشد یک سلول ایجاد شده و پس از بلوغ به یک گیاه کامل تبدیل میشوند.
1-8 کودهای زیستی
مسئله استفاده بیرویه و نادرست از سموم و کودهای شیمیایی بسیار جدی و از چند جنبه قابل بررسی است. از مهمترین آن آسیب زیست محیطی و بهداشتی است. جنبه دیگر نیز بُعد اقتصادی آن است. بقایا و آثار ترکیبات کود شیمیایی در محیط آب و خاک موجب برهم خوردن تعادل اکوسیستمها میشود. این معایب کودهای شیمیایی و هزینه بالای تولید آنها باعث شد که تولید کودهای زیستی مورد توجه جدی قرار گیرد. در نظامهای کشاورزی پایدار کاربرد کودهای زیستی از اهمیت ویژهای در افزایش باروری و حفظ حاصلخیزی پایدار خاک برخوردار است. امروزه استفاده از ظرفیتهای طبیعی ارگانیسمهای مفید خاکزی با هدف بهرهگیری از توانایی و پتانسیل آنها به منظور تولید حداکثر محصول مورد توجه قرار گرفته است (وسی، 2003).
دامنه میکروارگانیسمهای خاکزی مورد استفاده در تولید کودهای زیستی در طول قرن بیستم توسعه بسیاری یافته است و امروزه طیف وسیعی از باکتریهای خاکزی (انواع ریزوبیوم، سودوموناس، ازتوباکتر، آزوسپریلوم، باسیلوس و غیره)، قارچها (انواع قارچهای میکوریزی و اندوفیتی) و جلبکها با مکانیسمهای مختلف برای تولید کودهای زیستی استفاده میشوند. با این حال هنوز هم باکتریها فراوانترین انواع در تولید کودهای زیستی محسوب میشوند. امروزه کودهای زیستی در فرمولاسیونهای متفاوت برای محصولات مختلف کشاورزی از قبیل غلات، سبزی و صیفی، گیاهان صنعتی، باغات و گلخانهها استفاده میشوند (اسدی رحمانی، 1389). اهمیت استفاده از PGPRها برای گیاهان مختلف به عنوان کود زیستی هر روزه در حال افزایش میباشد و تحقیقات وسیعی در این مورد در حال اجراست. اما امکان استفاده از این موجودات در تحقیقات آزمایشگاهی گیاهی از جمله کشت بافت گیاهی هنوز در حال بررسی است. با توجه به اینکه این میکروارگانیزمها انواع مواد را به محیط اضافه میکنند، احتمال اینکه بر روی مراحل مختلف کشت بافت از ایجاد کالوس تا مرحله انتقال به خاک اثرات مثبتی داشته باشند وجود دارد. در این مورد گزارشهای بسیار اندکی موجود است و تحقیق بر روی این موضوع ضروری به نظر میرسد (احمدزاده، 1392).
1-9 باکتریهای محرک رشد گیاه (PGPRsها )
باکتریهای ریزوسفری محرک رشد گیاه (PGPR) به گروه نامتجانسی از میکروارگانیزمها اطلاق میشوند که سبب افزایش رشد گیاه میشوند (وسی ، 2003). جنسهای متعددی از باکتریها به عنوان انواع محرک رشد گیاه معرفی شدهاند. این باکتریها در بسیاری از فرایندهای کلیدی بوم نظام از جمله کنترل بیولوژیکی پاتوژنهای گیاهی، چرخه عناصر غذایی و استقرار گیاهچه دخالت دارند و امروزه برای اهداف کشاورزی و جنگلداری مورد توجه میباشند. این باکتریها ممکن است ریزوسفر، سطح ریشه و یا حتی فضای بین سلولی را کلونیزه نمایند (مک کلی ، 2001). باکتریهای ریزوسفری محرک رشد گیاه میتوانند با استفاده از مکانیزمهای مختلفی به طور مستقیم و غیرمستقیم در افزایش رشد و عملکرد گیاه نقش داشتهاند. در روش غیرمستقیم باکتریهای محرک رشد با استفاده از مکانیزمهای خاصی اثرات مضر بیماریهای گیاهی را تعدیل نموده و به این طریق موجب افزایش رشد گیاه میشوند. در روش مستقیم این باکتریها با تثبیت آزادزی نیتروژن، تولید متابولیتهای موثر در رشد گیاه، مانند هورمونهای گیاهی (اکسین، سیتوکینین، جیبرلین)، انواع ویتامینها بخصوص ویتامینهای گروه B و انواع اسیدهای آمینه مثل آرژنین، لیزین، تریپتوفان و بیوتین، افزایش حلالیت ترکیبات نامحلول مثل فسفر و پتاسیم از طریق تولید اسیدهای معدنی و آلی، تولید سیدروفورها و افزایش فراهمی عناصر کم مصرف به ویژه آهن و تولید آنزیم ACC دآمیناز موثر در کاهش اثرات سوء اتیلن تنشی به رشد بهتر گیاه کمک میکنند (گلیک و همکاران ، 2001).
باکتریهای ریزوسفری محرک رشد گیاه میتوانند با استفاده از مکانیزمهای مختلفی به طور مستقیم و غیرمستقیم در افزایش رشد و عملکرد گیاه نقش داشته باشند. در روش غیرمستقیم باکتریهای محرک رشد با استفاده از مکانیزمهای خاصی اثرات مضر بیماریهای گیاهی را تعدیل نموده و به این طریق موجب افزایش رشد گیاه میشوند. در روش مستقیم این باکتریها با تثبیت آزادزی نیتروژن، تولید متابولیتهای موثر در رشد گیاه، مانند هورمونهای گیاهی (اکسین، سیتوکینین، جیبرلین)، انواع ویتامینها بخصوص ویتامینهای گروه B و انواع اسیدهای آمینه مثل آرژنین، لیزین، تریپتوفان و بیوتین، افزایش حلالیت ترکیبات نامحلول مثل فسفر و پتاسیم از طریق تولید اسیدهای معدنی و آلی، تولید سیدروفورها و افزایش فراهمی عناصر کم مصرف به ویژه آهن و تولید آنزیم ACC دآمیناز موثر در کاهش اثرات سوء اتیلن تنشی به رشد بهتر گیاه کمک میکنند (گلیک و همکاران ، 2001).
باکتریهای آزادزی خاک که برای گیاهان مفید هستند، اغلب شامل تعدادی از باکتریهای مختلف نظیر Azotobacter،Azospirillum ،Pseudomonads ، Acetobacter،Burkholderia ، Bacilli و غیره هستند. باکتریهایPGPR میتوانند روی رشد و نمو گیاه به دو طریق غیر مستقیم و یا مستقیم تاثیر داشته باشند. تحریک غیرمستقیم رشد گیاه موقعی رخ میدهد که باکتریها، برخی از اثرات مضر یک موجود بیماریزا را توسط یک یا چند مکانیسم کاهش داده یا از عمل آن جلوگیری به عمل آورند. به عبارت دیگر، تحریک مستقیم رشد گیاه توسطPGPR معمولاً شامل تامین گیاه با یک ترکیب سنتز شده توسط باکتری یا تسهیل جذب عناصر غذایی از محیط میباشد. چون بسیاری از ترکیبات شیمیایی که جهت جلوگیری از آفات و بیماریها در گیاهان استفاده میشوند برای حیوانات و انسان خطرناک هستند و میتوانند در اکوسیستمهای طبیعی ماندگار شده و تجمع پیدا کنند، بنابراین مواد شیمیایی در حال جایگزین شدن با روشهای بیولوژیکی (استفاده از PGPR بیوکنترل) بیخطر برای محیط زیست جهت تحریک رشد گیاه هستند (وسی، 2003). خصوصیات مرتبط با بیوکنترل عوامل بیماریزای گیاهی عبارتند از:
1- سنتز آنتیبیوتیک
2- ترشح سایدروفور (کلاته کننده آهن) جهت به دست آوردن آهن محلول از خاک و تامین آن برای گیاه و بنابراین محروم کردن عوامل بیماریزای قارچی در کسب آهن محلول
3- تولید (باقری و همکاران، 1381)متابولیتهای با وزن مولکولی کم نظیر هیدروژن سیانید با فعالیت ضدقارچی
4- تولید آنزیمهای کتیناز، بتا-1،‏3-گلوکاناز، پروتئاز یا لیپاز که دیواره عدهای از سلولهای قارچی را میتوانند لیز کنند.
5- رقابت با عوامل بیماریزای گیاهی برای عناصر غذایی و محلهای روی سطح ریشه
6- کاهش تولید اتیلن تنشی (ناشی از حمله عامل بیماریزا در گیاهان با آنزیم ACC دآمیناز) (وسی، 2003).
1-10 مکانیسم عمل PGPR ها
باکتریهای ریزوسفری محرک رشد گیاه میتوانند با استفاده از مکانیزمهای مختلفی به طور مستقیم و غیرمستقیم در افزایش رشد و عملکرد گیاه نقش داشتهاند. در روش غیرمستقیم باکتریهای محرک رشد با استفاده از مکانیزمهای خاصی اثرات مضر بیماریهای گیاهی را تعدیل نموده و به این طریق موجب افزایش رشد گیاه میشوند. در روش مستقیم این باکتریها با تثبیت آزادزی نیتروژن، تولید متابولیتهای موثر در رشد گیاه، مانند هورمونهای گیاهی (اکسین، سیتوکینین، جیبرلین)، انواع ویتامینها بخصوص ویتامینهای گروه B و انواع اسیدهای آمینه مثل آرژنین، لیزین، تریپتوفان و بیوتین، افزایش حلالیت ترکیبات نامحلول مثل فسفر و پتاسیم از طریق تولید اسیدهای معدنی و آلی، تولید سیدروفورها و افزایش فراهمی عناصر کم مصرف به ویژه آهن و تولید آنزیم ACC دآمیناز موثر در کاهش اثرات سوء اتیلن تنشی به رشد بهتر گیاه کمک میکنند. اهمیت استفاده از PGPR ها برای گیاهان مختلف به عنوان کود زیستی هر روزه در حال افزایش میباشد و تحقیقات وسیعی در این مورد در حال اجراست. اما امکان استفاده از این موجودات در تحقیقات آزمایشگاهی گیاهی از جمله کشت بافت گیاهی هنوز در حال بررسی است. با توجه به اینکه این میکروارگانیزمها انواع مواد را به محیط اضافه میکنند، احتمال اینکه بر روی مراحل مختلف کشت بافت از ایجاد کالوس تا مرحله انتقال به خاک اثرات مثبتی داشته باشند وجود دارد. در این مورد گزارشهای بسیار اندکی موجود است و تحقیق بر روی این موضوع ضروری به نظر میرسد. گلیک (2001) عوامل پروبیوتیک از نظر عملکرد به دو گروه اصلی تقسیم میشوند: