این روش برای اولین بار در سال 1989 توسط تانکسلی و همکاران ارائه شد. برای انجام واکنش PCR، از دستورالعمل و مواد زیر استفاده میشود. تمامی مواد مورد استفاده برای PCR، بهجز DNA و آب مقطر دوبار تقطیر شده، به صورت تیوبهای آماده تجاری و محلول بودند که از شرکت سیناژن تهیه شدند.
. غلظت بهینه مواد بکار رفته در واکنش زنجیره ای پلیمراز در حجم 25 میکرولیتر شامل یک و نیم میکرولیتر از کلرید منیزیم 50میلی مولار ، 5/2 میکرولیتر بافر 10x، 1 میکرولیتر از پرایمر (10 پیکومول) ، 1/0 میکرولیتر از dNTP (10 میلی مولار)، 2/0 میکرولیتر آنزیم Taq DNA polymerase، 1 میکرولیتر از DNA نمونه های بیماران و گروه کنترل می باشد.
3-7-1 طراحی پرایمرها اختصاصی برای تعیین SNP
پرایمرهای مورد نظر جهت تکثیر قطعاتDNA طراحی و از کمپانی BioNeer کشور کره‌جنوبی خریداری شد. توالی پرایمرهای طراحی شده برای قطعات مورد نظر در جدول 2-3 آمده است.
جدول 2-3 توالی پرایمرهای مستقیم و معکوس
پلی مورفیسم
پرایمر
محصول PCR جفت باز
آنزیم محدود کننده
TGFB1 C-509T
F:5´-CCCGGCTCCATTTCCAGGTG-3´
R:5´-GGTCACCAGAGAAAGAGGAC-3
808
Bsu36I
3-7-2 dNTPs
dNTP ها از شرکت سیناژن تهیه شدند که حاوی 500 میکرولیتر از محلول ترکیب شده نوکلئوتیدهای dGTP و dTTP و dATP و dCTP با غلظت 10 میلیمول بودند. نگهداری آنها در فریزر 20- صورت گرفت
3-7-3 کلرید منیزیم(MgCl2)
محلول کلرید منیزیم از شرکت سیناژن تهیه شد. این محلول با غلظت 50 میلیمول و بدون رقیق کردن مورد استفاده قرار گرفت. به ازای هر نمونه در واکنش 20 میکرولیتری، 5/1 میکرولیتر از این محلول استفاده شد.
3-7-4 بافر واکنش PCR
بافر واکنش از شرکت سیناژن تهیه شد. بافر واکنش حاوی 500 میلیمول کلرید پتاسیم و 200 میلیمول تریس- اسید کلریدریک با pH=8 بود. غلظت این محلول به صورت 10X میباشد و بدون رقیق کردن در واکنش PCR استفاده میشود. بافر واکنش نیز در فریزر 20- نگهداری شده و قبل از استفاده ذوب شده و پس از استفاده دوباره به فریزر 20- منتقل میشود. به ازای هر نمونه در واکنش 20 میکرولیتری، 5/2 میکرولیتر از این محلول استفاده شد.
3-7-5 آنزیم Taq Polymerase
این آنزیم بطور مستقیم در واکنش PCR مورد استفاده قرار میگیرد. نگهداری این آنزیم در فریزر 20- درجه سانتیگراد است و برای استفاده بایستی بر روی یخ قرار گیرد. به ازای هر نمونه در واکنش 20 میکرولیتری 2/0 میکرولیتر استفاده میشود.
3-7-6 آب دوبار تقطیر شده استریل